Lipofectamine® LTX 试剂是一种专有的无动物源性制剂,其细胞毒性较低,适用于将 DNA 转染到真核细胞中。本参考资料提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂(货号 15338-100)将质粒 DNA 转染至 THP-1 人单核细胞性白血病细胞(ATCC 货号 TIB-202)中的推荐步骤。
转染重要指南
使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染到 THP-1 细胞中时,请遵循以下重要指南:
- 转染过程中向培养基中添加抗生素可能导致细胞死亡,尚未对 THP-1 细胞进行该测试。如果您要在转染过程中使用抗生素,请充分测试您的转染条件。
- 在各实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞;转染前确保细胞健康且细胞活力大于 90%。
- 转染既可在有血清的条件下进行,也可在无血清的条件下进行。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
- 使用 PLUS™ 试剂(货号 11514-015)可增强 THP-1 细胞中的转染性能。
- 我们建议,在络合之前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基(货号 31985-062)稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂。
- 关于其他专业转染方案(包括关于特定细胞类型的 PLUS™ 试剂和抗生素使用建议,以及基于载体的 RNAi 的实验方案),请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部。
- Lipofectamine® LTX 试剂在基于载体的 RNAi 实验中表现良好。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染,我们建议使用 Lipofectamine® RNAiMAX(货号 13778-075)。有关更多信息,请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部。
需要的材料
开始前请准备好以下试剂:
- 在添加了 10% 胎牛血清(货号 26140-079)和 0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液(货号 11140-050)的含 L-谷氨酰胺的 RPMI(货号 11875-085)中维持培养的 THP-1 细胞。在 37℃、5% CO2 的条件下培养细胞。
- 感兴趣的质粒 DNA(100 ng/μL 或更高)
- Lipofectamine® LTX 试剂(在 +4℃ 下储存直至使用)和 PLUS™ 试剂(如果需要;在 4℃ 下储存)
- Opti-MEM® I 减血清培养基
- 适当的组织培养板和耗材
按照以下步骤将质粒 DNA 转染至24孔板中的 THP-1 细胞中(对于其他规格,请参见下文的扩大或缩小转染规模)。指定的所有数量和体积均以每个孔为基础。
- 转染当天,进行细胞计数,以确定培养密度。在含有 0.5 mL 完全生长培养基的每个孔中铺 1×105 个细胞。转染当天细胞密度应为 50-80% 汇合度。
- 对于每个孔的待转染细胞,将 0.5 μg DNA 稀释到 100 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
- 如果使用 PLUS™ 试剂:使用前轻轻混匀 PLUS™ 试剂,然后将 0.5 μL PLUS™ 试剂(与 DNA 的比例为 1:1)直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混匀并在室温下孵育 5-15 分钟。
- 对于每个孔的细胞,将 1.25-2.25 μL Lipofectamine® LTX 稀释到上述稀释后的 DNA 溶液中,轻轻混匀并在室温下孵育25分钟,以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。
- 将 100 μL DNA-Lipofectamine® LTX 复合物直接添加到含有细胞的每个孔中,并轻轻来回晃动孔板使其混匀。
- 转染后不必去除复合物。转染后,将细胞置于 CO2 培养箱中在 37°C 下孵育 18-24 小时,然后测定转基因表达。
要在不同规格的组织培养容器中转染 THP-1 细胞,应根据相对表面积按比例调整 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量,如表格所示(指定的量以每个孔为基础)。
培养容器 | 每孔 表 面积1 | 铺板培养基体积 | 细胞/孔 | 稀释 培养基 体积2 | DNA | Lipofectamine® LTX 试剂 | PLUS™ 试剂 |
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96孔 | 0.3 cm2 | 100 μL | 2×104 | 20 μL | 100 ng | 0.25-0.45 μL | 0.1 μL |
48孔 | 1 cm2 | 200 μL | 4×104 | 40 μL | 200 ng | 0.5-0.9 μL | 0.2 μL |
24孔 | 2 cm2 | 500 μL | 1×105 | 100 μL | 500 ng | 1.25-2.25 μL | 0.5 μL |
12孔 | 4 cm2 | 1 mL | 2.0×105 | 200 μL | 1 μg | 2.5-4.5 μL | 1.0 μL |
6孔 | 10 cm2 | 2 mL | 5.0×105 | 500 μL | 2.5 μg | 6.25-11.25 μL | 2.5 μL |
1 表面积可能因生产商而异。
2 如果 Lipofectamine® LTX 试剂的体积太小而无法准确分配,并且无法合并稀释液,则在 Opti-MEM® I 减血清培养基中将 Lipofectamine® LTX 试剂预稀释10倍,然后分配10倍的量(应至少为 1.0 μL/孔)。丢弃任何未使用的经稀释 Lipofectamine® LTX 试剂。