使用 Lipofectamine 干细胞试剂在 mTeSR1 培养基中于 Geltrex 基质上转染多能干细胞

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PSC 生长培养基、传代试剂以及络合培养基

高效转染的理想起点是在无饲养层培养体系（如 mTeSR 1 培养基 [STEMCELL Technologies]）中于底物（如 Gibco Geltrex 基质）上扩增未分化人多能干细胞 (PSC)。加入 Gibco Versene 溶液后，在这种培养系统中生长的 PSC 可成功传代培养或传代。在扩增和接种或重新铺板进行转染期间，建议使用此项基于 EDTA 的温和解离方法。该方法有助于确保 PSC 在传代过程中不会分化或死亡，并得到由小细胞团块构成的均一起始细胞集落用于高效转染。

传代

• 按照您选择的培养方式（如由 Geltrex 基质包被的6孔板、60 cm 培养皿或 T-75 培养瓶）在 mTeSR1 培养基中维持培养 PSC。在6孔板中增殖 PSC、在24孔板中转染是较为便捷的方式，本方案便采用了这些方式。
• 每 3-5 天在汇合度达到约 85% 前，对 PSC 传代一次。
• 小贴士：在使用 Versene 溶液进行常规 PSC 传代以扩增的过程中，重新铺板包含 5-10 个细胞的大团块能促使细胞在 mTeSR1 培养基中重新附着到 Geltrex 基质上以及存活，而无需添加 Gibco RevitaCell 补充剂。

使用 Geltrex 基质预包被24孔板

1. 取 Geltrex 基质，加入含有 GlutaMAX 补充剂的冷 Gibco DMEM/F-12 培养基（货号 10565）中，制备 Geltrex 基质的 1:100 稀释液。
2. 使用前，向24孔板的每个孔中加入 300 μL 稀释的 Geltrex 基质，并在 37℃ 下孵育 ≥1 小时。

• 小贴士：可提前制备用 Geltrex 基质包被的培养板，并在 4℃ 下储存最多2周。细胞铺板前，先在室温下平衡至少1小时。

接种用于转染的细胞

1. 当无饲养层的 PSC 培养物的汇合度低于 85% 时，移除 mTeSR1 培养基，在6孔板中每孔使用 2 mL DPBS（无钙离子和镁离子）轻轻洗涤细胞两次。
   重要说明：由于钙离子和镁离子可能干扰 Versene 溶液的作用，因此请使用不含钙离子和镁离子的 DPBS。一次最多处理1至3个孔，以便准确地对解离过程进行计时。
2. 每孔加入 1 mL Versene 溶液并在 37℃ 下孵育 3-5 分钟。
   重要说明：如果使用其他基于 EDTA 的解离试剂或酶解离方法，最佳孵育时间可能有所不同。
3. 在显微镜下观察培养物，在各细胞收缩并在集落中可见但仍附着于孔内的情况下吸出 Versene 溶液。
4. 在每个孔中加入 1 mL mTeSR1 培养基（含或不含 RevitaCell 补充剂或 rho 激酶抑制剂），以使 Versene 溶液失活。
   重要说明：与常规传代不同，应将 PSC 培养物解离为包含 3-5 个细胞的小团块，以促进高效转染。如果成簇集落太大（>10 个细胞），只有外缘周围才能有效转染。
5. 用 1 mL 移液器吹下孔内表面附着的细胞，并在板中吹打3次，将细胞解离成包含 3-5 个细胞的小团簇。
6. 在显微镜下确认不存在残留的大团簇。
7. 需要时再吹打3次，并在显微镜下观察。
   重要说明：该方法也可能产生一些单个细胞，加入 RevitaCell 补充剂或 rho 激酶抑制剂将促进其存活。使用其他酶解离试剂可能需要加入 rho 激酶抑制剂以促进细胞充分存活。
8. 将每个孔的内容物收集到 15 mL 锥形管中。
9. 进行总活细胞计数，包括单个细胞和小团簇内的各个细胞。
   重要说明：正在增殖的 PSC 培养物在转染期间需要空间进行扩增，所以请按推荐的起始细胞数（步骤12）进行铺板以在转染当天达到 30–60% 的汇合度。
10. 使用含有 RevitaCell 补充剂的额外 mTeSR1 培养基稀释至最终浓度为100,000个细胞/mL；如果不含有 RevitaCell 补充剂，则稀释至150,000个细胞/mL，以将铺板效率差异考虑在内。
11. 从预包被24孔板的各孔中吸出 Geltrex 基质。
12. 向预包被的24孔板中加入使用 mTeSR1 培养基（含或不含 RevitaCell 补充剂）制备的 0.5 mL PSC 悬液，以按 50,000–75,000 个细胞/孔进行铺板。
13. 将平板放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 下过夜培养。
    重要说明：仅在转染前1天进行 PSC 铺板，以防止接种的集落生长过大。

在转染当天更换培养基

在第二天，吸出用过的培养基，并在每个孔中加入 0.5 mL 新鲜 mTeSR1 培养基（含或不含 RevitaCell 补充剂）。

• 小贴士：在转染当天无需加入 RevitaCell 补充剂或 rho 激酶抑制剂，但在转染期间加入可以促进细胞存活。

DNA 转染方案

请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对在 mTeSR1 培养基中使用 Invitrogen Lipofectamine 干细胞转染试剂进行了优化：

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因构建体转染的 PSC 以进行终点分析（图1）。

mRNA 转染方案

请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对在 mTeSR1 培养基中使用 Lipofectamine 干细胞试剂进行了优化：

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经荧光 mRNA 转染的 PSC 以进行终点分析（图2）。

图2.人胚胎干细胞 (H9 hESC) 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 70%，(B) 明场图像。在 mTeSR1 培养基中于 Geltrex 基质上用 250 ng GFP mRNA 和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后48小时，显示出 H9 hESC。

核糖核蛋白 (RNP) 转染方案

RNP 复合成分：

• Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 核酸酶（货号 B25641）
• gRNA（参见“通过体外转录法设计和生成 gRNA”）

在转染当天（将 PSC 铺于24孔板的单孔后1天）执行以下步骤，这些步骤已针对在 mTeSR1 培养基中使用 Lipofectamine 干细胞试剂进行了优化：

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，使用荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因构建体转染的 PSC，并使用 Invitrogen GeneArt 基因组剪切检测试剂盒或类似检测试剂盒分析双链断裂 (DSB) 形成情况（图3）。

图3.H9 hESC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 73%，(B) 明场图像。在 mTeSR1 培养基中于 Geltrex 基质上用 500 ng GeneArt Platinum Cas9 核酸酶、125 ng gRNA、50 ng GFP mRNA 和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后24小时，显示出 H9 hESC。(C) 转染后48小时，H9 hESC 的基因组剪切检测分析显示，EMX1 基因座内形成 72% 的 indel。”

通过体外转录法设计和生成 gRNA

除 RNP 转染效率外，在给定基因座处 DSB/indel 形成的效率也可能取决于 gRNA 设计。使用 Invitrogen GeneArt CRISPR 检索和设计工具（获取链接：thermofisher.com/crisprdesign）来检索我们数据库中针对人类基因组中每个基因的 >600,000 条预设计 gRNA 序列。这些预设计的 gRNA 针对基因敲除进行了优化，且通常以每个基因的前三个转录外显子为靶标。

使用 Invitrogen GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒（货号 A29377）克隆并生成您自己的 gRNA。可采用 Invitrogen Qubit 3 荧光计（货号：Q33216）联合 Invitrogen Qubit RNA BR 检测试剂盒（货号：Q10210）定量测定 gRNA 浓度。