Luminex™检测支持—入门

具有确定光谱特性的微珠与蛋白质特异性捕获抗体偶联，并与样品（包括已知蛋白质浓度的标准品、对照样品和测试样品）一起添加到微孔板的孔中。靶蛋白在2小时的孵育过程中与捕获抗体结合。洗涤微珠后，加入蛋白质特异性生物素化的检测抗体，并与微珠一起孵育1小时。然后，去除过量的生物素化检测抗体，加入链霉亲和素偶联的荧光蛋白 — 藻红蛋白（SAV-RPE），并孵育30分钟。 SAV-RPE与生物素化的检测抗体结合，形成四元固相夹心。洗涤去除未结合的SAV-RPE后，用Luminex^TM检测系统分析微珠。通过监测微珠的光谱特性和相关的藻红蛋白（RPE）荧光的量，可以测定一种或多种蛋白质的浓度。Luminex™技术与以下Luminex™分析仪兼容：

• MAGPIX™系统 — 经济实惠、高效、紧凑设计
• Luminex™100/200™系统 — 多功能、高效、广泛用于多重检测
• FLEXMAP 3D™系统 — 高通量（同时分析高达500个）和自动化兼容

Luminex™xMAP™技术基于聚苯乙烯或顺磁微球或微珠，其内部用不同强度的红色和红外荧光团标记。每个带颜色的微珠都有一个唯一的编号，称为“微珠区域”，以区分不同的微珠。对于Novex™多重免疫检测试剂盒，每个微珠组用一种捕获抗体包被以用于一种特定分析物的检测。然后可将多种分析物特异性微珠在96孔检测板的单个孔中混合，使用其中一种Luminex^TM仪器同时进行多种靶标的检测和定量。我们提供使用聚苯乙烯珠或顺磁磁珠进行的多重检测试剂盒。 

观看视频，了解如何在Luminex™仪器平台上使用Novex™多重微珠试剂盒同时检测多种蛋白质。

Novex™多重检测基于Luminex™ xMAP™技术，这个多功能平台为用户提供更大的灵活性和更多的分析物检测选项。无论您是测试单个还是多种分析物，Novex™多重检测都可以使用高效易懂的方案提供准确的分析性能。所有检测均经历了我们为ELISA进行的相同的开发、确认、制造和质量控制标准化流程。每批Novex™多重检测以及ELISA检测均完全适用相应的样品类型（即物种特异性血清、血浆和细胞培养上清液），并根据以下性能特征进行评价：

• 特异性 — 筛查每种分析物以确保其在多重测试中与其他分析物没有显着的交叉反应性
• 灵敏度 — 评价每种分析物的功能灵敏度（与背景区分的能力）和检测下限（LLOD）
• 精确度/准确度 — 多重检测具有良好的分析内精确度（<10％CV），批间精密度（<10％CV）和批次间一致性（<20％CV）；这些值与大多数ELISA测试相当或更好

针对匹配的ELISA定期测试Novex™多重检测。对两种测定形式的分析比较确保了多重检测可以有效使用并且获得与ELISA相当的结果。因此，使用ELISA定量样品中多种分析物的研究完全可以使用Novex™多重检测进行，并且后者可以获得更高的分析效率、经济效益和性能。示例如下：

通过ELISA（y轴）和Novex多重检测（x轴）测试组织培养上清液中的鼠GM-CSF。样品稀释度的3个对数值的相关性为0.9868

更多数据请见白皮书。

点击此处，查看用于多重检测和分析的Luminex™仪器的概述。

MAGPIX™系统是一款紧凑型台式仪器，可以多重检测高达50种分析物。它是一款功能强大且经济高效的多重检测工具。简化的启动和关闭方案以及最低的维护要求使系统易于使用 — 对新手和有经验的用户都是理想选择。它具有简单的开箱即用设置和交互式软件。MAGPIX系统分析使用磁铁固定的磁珠，使用发光二极管（LED）激发磁珠，然后使用CCD摄像机检测和分析磁珠。

请查看下表中的仪器设置：

注意：在运行检测之前，请探针高度调至适当，并校准和验证系统。

*可在数据获得期间调整体积以优化微珠计数。

应使用无热原/无内毒素的试管采集血清样品。将全血在室温下静置15-30分钟，使其凝固。在4℃冷冻离心机中以1000-2000×g离心10分钟以分离细胞。用无菌巴斯德移液器将上清液转移到冷却的干净聚丙烯管中。处理时使样品保持在2-8°C。 

如果血清有待日后分析，请将其以0.5 mL体积分装后储存在-80℃。 避免多次反复冻融。如果可能，避免使用溶血或有脂血症的血清。我们建议，分析前，在解冻后立即通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清样品，以防止堵塞过滤板和/或探针。按照试剂盒提供的检测程序进行适当的稀释。

在冷冻离心机中以2000×g离心10分钟，将细胞从血浆样品中分离。需要在该力下离心以去除样品中的血小板。用无菌巴斯德移液器将上清液转移到冷却的干净聚丙烯管中。处理时使样品保持在2-8°C。 

如果血浆有待日后分析，请将其分装至聚丙烯微量离心管并储存在-80℃。 避免多次冻融循环。分析之前，将样品置于冰上，使其解冻。所有血浆样品应在分析前在冷冻微量离心机中通过离心（4℃下以14000rpm转速离心10分钟）澄清。遵循试剂盒提供的检测程序进行适当的稀释。

细胞应处于对数生长期。在适当的细胞培养瓶中根据需要刺激细胞。使用无菌技术，用移液器吸移所需体积的条件细胞培养基，并将培养基转移到干净的聚丙烯微量离心管中。在冷冻微量离心机中，在4℃下以14000rpm将培养基离心10分钟，以去除细胞或细胞碎屑。将澄清的培养基等分至干净的聚丙烯微量离心管。这些样品即可用于检测。或者，可将澄清的培养基样品等分并储存在-80℃用于将来分析。避免多次冻融循环。将冷冻样品置于冰上使其解冻，并应在解冻后立即进行测试。分析前，解冻的样品应立即在冷冻微量离心机中通过离心（4℃下以14000rpm转速离心10分钟）澄清，以防止堵塞Luminex™探针和/或过滤板。遵循试剂盒提供的检测程序进行适当的稀释。

我们建议遵循下面提供的的方案，这是基于组织提取试剂I（货号FNN0071）开发并显示了ELISA和Luminex™技术之间的良好相关性。该程序已应用于多种组织类型。但是，我们建议您针对所使用的每种组织样品进行优化。可以使用类似的提取试剂/裂解缓冲液。 

1. 在使用前将蛋白酶抑制剂添加到组织提取试剂中。
2. 称量组织样品。
3. 每1克组织加入10 mL组织提取试剂。
4. 匀化组织。
5. 以10000rpm离心样品5分钟以沉淀组织碎屑。
6. 收集上清液。按照试剂盒中提供的检测程序进行适当的稀释；这是为了防止/最小化提取液或裂解缓冲液中存在的去垢剂对抗体 - 抗原结合的潜在抑制。通常，组织匀浆或细胞裂解物（取决于所用的裂解缓冲液）需要稀释5至10倍，以将去垢剂浓度降低至≤0.01％。然而，基于目标细胞因子/蛋白质的浓度，各自的试剂盒/样品可能需要用检测稀释液或标准品稀释液进一步稀释。

注意：如果要储存样品，请将其等分并冷冻于-80°C。避免多次冻融循环。

仅使用新鲜尿样。使用试剂盒中提供的检测稀释液将样品稀释2倍。样品的最终稀释度为4倍，所有结果均应乘以4。如果需要，在分析前通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清样品，以防止堵塞过滤板和/或探针。

将关节液收集到非肝素化管中，并在样品采集的30分钟内以1000×g离心10分钟。在进行随后的分析之前，关节液的无细胞部分应储存在-80℃。分析前，所有样品需要通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清，以防止堵塞过滤板。在加入检测之前，用检测稀释液以1：1稀释样品。参考文献：Raza K等人（2005） 关节炎研究与治疗7（4）: R784–R795。

分析前，所有样品需要通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清，以防止堵塞过滤板。然而，CSF具有相对较低的粘度，并且除非存在感染状态（WBC的丰度），否则其不需要澄清并可以直接应用于检测。使用神经科学缓冲液试剂盒（货号LNB0001）中提供的检测稀释液稀释2倍。 

支气管肺泡灌洗（BAL）液应收集于无菌注射器中，并在分析之前持续保存于冰上。或者，可以将BAL等分至可用样品大小并冷冻（以便只会经历一次冻融）。分析前，所有样品需要通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清，以防止堵塞过滤板。在应用于检测板之前，用检测稀释液稀释2倍。

收集后，应立即将宫颈取样海绵放置于冰上。样品应在-20°C下储存长达一周，然后储存于-80°C直至做好检测准备。解冻后，应将海绵称重并放入Eppendorf管中，使用镊子进行转移，每次使用后用乙醇清洁。向每个管中加入200μL冰冷的提取缓冲液（配方见下文），并在4℃下孵育过夜。 然后将海绵和提取缓冲液转移到具有0.2μm醋酸纤维素过滤器的微量离心管中，并在4℃下以13000rpm离心10分钟。 然后测试洗脱液中的细胞因子表达。

提取缓冲液

50 mM HEPES，pH 7.5 

1 mM Na₃VO₄

150 mM NaCl 

1 mM NaF

1 mM EDTA 

0.1% Tween™ 20

25 mM EGTA

10% 甘油

隔离牙齿周围的部位，将一张牙周滤纸插入牙齿周围的牙龈袋中，持续30秒。取出滤纸，在室温下使用50μL PBS提取4次，每次5分钟。每次提取物可以组合和单独进行分析。在应用于检测之前，用检测稀释液稀释2倍。

我们没有在内部专门测试过唾液样品。唾液含有多种蛋白水解酶。离心样品很重要，并且确保不要将任何细胞材料或碎屑吸移到检测板中。我们建议在样品中加入一些抗蛋白酶（例如，10到50 U / mL的Trasylol或抑肽酶），以保护蛋白质免受酶降解。您可以像处理上清液一样处理样品；遵循对细胞培养上清液进行检测所述的程序进行处理。 

下述方案已经应用于多种人类和小鼠细胞系。您应该为您自己的应用优化细胞提取程序。 

细胞裂解程序

非贴壁细胞：

低速离心以沉淀细胞。从沉淀中移去培养基，用冰冷的PBS洗涤两次。去除PBS，将细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中（推荐细胞裂解液浓度为2-5 mg/mL）。在冰上孵育15分钟，偶尔涡旋。将裂解物转移至微量离心管中，并在2-8℃下以14000rpm离心10分钟。 将澄清的裂解液等分至干净的微量离心管中，并测定总蛋白浓度。

贴壁细胞：

从细胞中去除组织培养基，用冰冷的PBS洗涤两次。去除PBS，加入细胞裂解缓冲液（推荐细胞裂解液浓度为2-5μg/mL），并在冰上孵育15分钟。收集细胞裂解液，并将其转移至微量离心管中。在2-8℃下以14000rpm离心10分钟。 将澄清的裂解液等分至干净的微量离心管中，并测定总蛋白浓度。裂解液应在-80°C下冷冻储存，或在收集后立即进行分析。冷冻样品避免多次冻融循环。分析前，将样品完全解冻、充分混合并通过离心（14000rpm，10分钟）来澄清，以防止堵塞过滤板。

推荐的细胞裂解缓冲液：

NP40细胞裂解缓冲液（货号FNN0021） 

注意：使用NP40裂解缓冲液制备的裂解液必须在运行检测之前稀释至少5倍。

或者

50 mM Tris，pH 7.4

50 mM NaF

260 mM NaCl

1 mM Na₃VO₄

5 mM EDTA 

0.02% NaN₃

1% Nonidet P40 

NP40细胞裂解缓冲液（不含蛋白酶抑制剂混合物和PMSF）在2-8°C下的稳定期为2-3周，或在-20°C下分装保存6个月。 

 在即将使用前在NP40细胞裂解缓冲液中新鲜添加：

• 1 mM PMSF（DMSO中的0.3 M原液）
• 蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，货号P-2714）

替代细胞提取缓冲液

细胞提取缓冲液（货号FNN0011） 

注意：使用细胞提取缓冲液制备的裂解液必须在运行检测之前稀释至少10倍。

或者

10 mM Tris，pH 7.4

2 mM Na₃VO₄

100 mM NaCl 

1% Triton X-100

1 mM EDTA 

10% 甘油

1 mM EGTA 

0.1% SDS

1 mM NaF 

 0.5% 脱氧胆酸盐

20 mM Na₄P₂O₇ 

细胞提取缓冲液（不含蛋白酶抑制剂混合物和PMSF）在2-8°C下的稳定期为2-3周，或在-20°C下等分保存6个月。 

在即将使用前将新鲜裂解添加至细胞提取缓冲液中：

• 1 mM PMSF（DMSO中的0.3 M原液）
• 蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，货号P-2714）

虽然我们的大多数Luminex™多重检测试剂盒可与其他单重检测试剂盒结合使用，以实现更多重数的多重检测，但也有一些例外和限制。请仔细阅读产品手册以了解该试剂盒特定的指南。在多重检测的开发中组合微珠混合物和检测抗体混合物的说明如下所示。

注意：在准备多重检测之前，验证每个分析物是否由唯一的微珠区域代表至关重要。这确保了每个微珠在多重检测开发中的相容性。可以组合多达10个微珠浓缩物（预混合的多重复合物和/或单重复合物）以增加被监测的蛋白质的数量。每个试剂盒所使用的缓冲系统也必须兼容。通常，使用缓冲液试剂盒货号LHB0001的Luminex™检测试剂盒不应与使用缓冲液试剂盒货号LHB0002的检测试剂盒混合使用。此外，可以单独分析蛋白质标准品或与其他蛋白质标准品组合分析，以获得更多重数的多重检测结果。请勿合并4小瓶以上。

多重抗体微珠：

可以使用下面给出的公式计算多重检测所需的体积：

所需的1X抗体微珠混合物的总体积

0.0275 mL x（孔数）= ________________

所需的每种10X抗体微珠浓缩物的体积

[所需的1X抗体微珠混合物的总体积]÷11 = ______

所需的工作清洗液

[1X抗体微珠混合物的总体积] - [（10X抗体微珠的体积）x（重数）] = ________

如需制备用于多重检测的1X抗体微珠混合物，可将微珠和工作洗涤液（使用通过上述公式计算的体积）吸移至箔包裹的管中。将管涡旋30秒，然后超声处理30秒。 该混合物即可用于多重检测。如果需要，该抗体微珠混合物可以在2-8℃下储存过夜。 

多重检测抗体：

可以使用下面给出的公式计算多重检测所需的体积：

所需的1X检测抗体混合物的总体积

0.110 mL x（孔数）= ________________

所需的每种10X检测抗体浓缩物的体积

[所需的1X检测抗体混合物的总体积]÷11 = ______

所需的检测抗体稀释液
[1X检测抗体混合物的总体积] - [（10X检测抗体的体积）x（重数）] = ________

如需制备用于多重检测的1X检测抗体混合物，可将检测抗体浓缩物和检测抗体稀释液（使用上述公式计算的体积）吸移至管中。温和混匀。该混合物即可用于多重检测。如果需要，该检测抗体混合物可以在2-8℃下储存过夜。 

多重检测标准品：

可以单独分析蛋白质标准品或与其他蛋白质标准品组合分析，以获得更多重数的多重检测结果。请勿合并4小瓶以上。

如果在检测当天无法读板，可以将板子封上，在黑暗中于2-8°C下保存过夜以便在第二天读取，荧光强度不会有显著损失。当您准备好读板时，将板放置在轨道摇床上使其升至室温（仍然避光）。从储存的板中吸出工作洗涤液，加入100μL新鲜的工作洗涤液。在分析之前，将板置于轨道摇床上以500-600rpm旋转2-3分钟。