细胞计数和成像仪器支持 - 故障排查

您可点击此处访问相应的页面。在“细胞成像系统”部分下，找到并点击您的EVOS™成像系统的链接。之后您即可发现三个下载链接和若干说明。我们建议您至少每六个月检查一次更新，或者在您的系统出现任何软件方面的小问题时检查一次更新。

如果镜头一直在样品上移动，可能是对焦太快且丢失焦平面（如果是手动聚焦）的问题，或者是物镜校准的问题（如果使用自动聚焦）。最好使用系统自带的FL Auto校准载玻片校准物镜。首先检查看您的物镜是长工作距离（LWD）物镜或盖玻片矫正（CC）物镜。如果是盖玻片矫正（CC）物镜，则只能采用超短的工作距离，通过薄盖玻片进行成像，不能通过载玻片、微孔板或培养皿内的塑料底进行成像。如果使用高放大倍数或者油镜，利用肉眼观察，向上移动物镜接触到样品的底部，然后缓慢地朝远离样品的方向移动物镜，进一步聚焦。

物镜镜头在与样品的刮擦中会受到严重的损毁。如果发生刮擦，检查物镜的损坏情况。

对于EVOS™成像系统而言：

• 确认灯已打开（很容易检查：在载物台上放一块薄纸）
• 确认样品不要太混浊；与校准载玻片或其他薄的单细胞样品载玻片进行对比。
• 检查物镜，确认物镜转轮对齐并且物镜完全转动到它的位置。
• 对于EVOS™FL成像系统：移动光立方的位置
• 对于EVOS™FL Auto成像系统：检查所有的USB端口，确保显微镜与电脑连接。
• 对于明场设置，检查聚光镜滑块位置，确保聚光镜滑块在预定的位置。

Countess™ II或Countess™ II FL的最新版软件请见此处。如果遇到任何问题，请务必浏览网站看是否提供新版软件，因为软件是定期更新的。您也可点击此处注册您的Countess™ II或Countess™ II FL仪器，从而在任何软件更新时接到通知。

亮度和大小滑动条确立了成像算法的阙值，使得用户可以同时设置样品亮度和大小的范围。如果样品的参数设定为最大值，所有亮度水平和大小都被计数，因此无法进行后续调节。您可以移动滑动条的末端或者点击滑动条末端的图标，缩小计数的亮度或大小范围。在“调节”屏幕上操作实例如下：在亮度滑块上重复的点击“调光”图标或者手动移动滑块底部，注意绿色亮度杆高度减少。最终压缩的亮度范围可在整个亮度级内滑动调整，从而可仅涵盖暗淡细胞、亮细胞，或根据需要计数的对象调节。对于细胞大小，可采取相同的方式调节。

选择“默认”程序，恢复大小、亮度和circularity门限至最大值。

屏幕亮度不均匀可以通过重设光立方盒修复。首先，确保您的仪器上安装有最新版本的Countess™ II或Countess™ II FL软件（可点击此处下载）。如果软件已经更新，每次仪器重启时，光立方盒应该相应的调整。同时您也可以在设置菜单下，选择“改变光立方”选项，使得光立方重置，之后关闭仪器再打开。如果您没有光立方或者如果您拥有Countess™ II仪器（没有荧光选项），此过程可能会帮助您解决屏幕亮度不均匀问题。

首先，确保您的Countess™ II或Countess™ II FL仪器上安装了最新版本软件（可点击此处下载）。您可能需要手动调节焦距并设定标称焦距，确保自动对焦功能具有一个聚焦到细胞上的设定点。一旦细胞采用0.4%台盼蓝1：1染色并涂在载玻片上，可能需要沉淀细胞约30秒。然后将载玻片放置在仪器上，在让仪器自动对焦之后，您需要通过手动聚焦来刷新明场聚焦。理想情况下，聚焦后活细胞稍微有点亮，而死细胞全部都是黑的，活细胞中心是亮的。您可能想放大来更好的观察细胞，在您拍照前，使用聚焦滑动条手动调节聚焦。一旦聚焦完成之后，您可以点击蓝色“设置”框来设置标称焦距；设置标称焦距会提高自动对焦与以后使用载玻片时的一致性。

确保屏幕上没有会干扰自动对焦并使得样品很难出现在正确的焦平面上的可见气泡或残渣。

启动聚焦的更多指导准则请见此手册第20页。

在细胞计数之前降低明场和荧光强度。

首先按“Capture（捕获）”计数细胞，然后点击“调节”按钮并确保大小、亮度和circularity门限都处于最大值，以便计数所有细胞。进入到“Adjust（调节）”界面后，可以调节死细胞和活细胞的大小、亮度和circularity，来确保您在调节界面同时选择活细胞和死细胞计数按钮，从而将活细胞和死细胞的大小和亮度完全调到了最大值，确保所有的细胞都被计数，之后如果您想要排除特定大小和特定亮度的细胞，可将其减小。

您也可以选择“Default（默认）”用户预置文件来重新将大小、亮度和circularity设定为最大值。

如果孔洞已经完全最大了，CSV应该指出活细胞和死细胞的细胞尺寸最大和最小值为0-60以及亮度的最大和最小值为0–255。

使用测试珠时，我们推荐对珠子储备液进行高速涡旋震荡30s，之后吸出10 µL立刻加入10 µL台盼蓝。珠子和台盼蓝混合物应该多次上下吹打确保混合均匀，混合之后立刻将10 µL样品加到载玻片上。珠子快速沉淀，会影响浓度。您可以同时观察珠子图像以确保所有出现在Countess™屏幕上的珠子都被计数算法计数。

屏幕上有一层薄的屏幕保护塑料薄膜，使用前应该去除。

光源调节可控制LED光线强度，相机增益和曝光时间，并可在捕获图像前调节图像亮度和对比度。细胞上样后，右侧将会出现一个调节光源强度的竖条。其往往用于调低亮度，以使背景稍稍黯淡，从而使活细胞/死细胞之间具有较好的对比度。如果仪器上没有光立方，明场的最佳光强度为10-20左右；如果存在光立方，可轻微调高20-30左右，具体因样品而异。

获得图像后，也可以调节细胞用于计数算法的细胞大小范围和细胞亮度。此操作不会改变图片的实际亮度或图片外观，但是可以筛选计数的细胞。按下“捕获”按钮计数细胞后，可以点击“Adjust（调节）”按钮并向一端移动滑动条，确保尺寸、亮度、circularity为最大值，计数所有细胞。您进入到“Adjust（调节）”界面后，可以调节死/活细胞的尺寸、亮度、circularity。确认您在调节界面选择了活/死细胞按钮，从而最大限度放大活/死细胞群的大小和亮度门限。这是细胞出现在图像中却没有被计数的主要原因。最好先为活/死细胞群扩大门限，确保所有细胞都被计数，之后如果您想要排除特定大小和特定亮度的细胞，可减小门限。

明场下计算细胞浓度时，假定您在台盼蓝中1:1稀释细胞，所以其已经将稀释度计算在内并且将值乘以2，因此显示出来的细胞浓度是在台盼蓝中稀释前的原始细胞浓度。荧光计数显示出的总细胞浓度并没有计算任何稀释度，是载玻片上的细胞真实浓度。

确认仪器上插有已FAT格式化的U盘。

如果您从同一细胞样品中吸取不同的样品量，技术差异可能是吸取和混合操作所致。请使用最近校准过的移液器并确认细胞悬浮液充分混合，在加入10 µL到台盼蓝中之前反复上下吹打。样品与台盼蓝混合后，上下吹打充分混合并立即滴加到Countess™载玻片上。

如果您重复计数同一块载玻片，目测检查图像中的细胞都正确计数。确保各次计数之间没有振动和摇动载玻片。可能每一次载玻片插入时观察的视野有轻微的不同，因此根据细胞的浓度和均一性，在同一块载玻片上进行重复计数时将会有一些差异，尽管差异通常低于10%。当计数少量细胞时，很小的视野改变仅仅导致少量的细胞变化却会有很大的影响，所以在高浓度下计数细胞能减少结果波动。

有两个主要原因：相应的细胞真的死了；需要调节焦距。某些情况下，高度染色的细胞在明场下看起来像是死细胞；这些细胞需要荧光活性染色剂。

确保细胞被正确聚焦，即确保活细胞中心明亮而死细胞全黑。如果细胞聚焦不当或在屏幕上看上去暗淡，Countess™ II或Countess™ II FL仪器就会将它们计为死细胞。如果细胞聚焦良好、有一个明亮的中心，却被计为死细胞，确认它们在适当细胞大小范围内并尝试调节设置。如果细胞在台盼蓝中暴露太久，会影响其活性。因此，为确保获得最好的结果，每次试验应单独准备新的载玻片进行计数。

某些情况下，高度染色的细胞在明场下看起来像是死细胞；这些细胞需要荧光活性染色剂。

• U盘必须FAT32格式化；请在进行后续处理前确认这一点。目前，您应该假定所有其他格式都无法工作。
• 更新文件必须在U盘根目录下，不能位于文件夹或子文件夹下。
• 文件不能以任何方式重命名。
• 文件传输过程中不能压缩。在传输过程中必须保证未损坏。
• 设备需要几秒时间识别U盘。
• 如有必要，通过USB鼠标检查USB端口功能。

把USB格式化为FAT32：

1. 将需要格式化的U盘插入到电脑，找到“我的电脑”
2. 右键点击U盘，选择格式化
3. 选择文件系统FAT32。
4. 点击“开始”。

格式化会导致U盘中所有文件丢失，因此在格式化前请确认您已经将重要的文件复制到其他的驱动盘中。格式化后，在更新Countess™ II或Countess™ II FL软件之前，需要将软件重新传输到U盘中。

Countess™ II或Countess™ II FL仪器可同时通过USB鼠标控制，因此您可以尝试将USB鼠标插入到仪器的任一USB端口，重装软件并进行软件更新。

初代Countess™全自动细胞计数仪已经停产了，但我们依然为此设备提供耗材。初代Countess™自动细胞计数仪最新的软件和固件仍可点击此处 下载，请见页面底部“初代Countess软件下载”部分。仪器免费赠送的U盘之中也含有这种软件。该软件支持处理细胞计数数据并且可以将您的数据以PDF的格式保存，以便打印或归档。

注：为替代初代Countess™自动细胞计数仪，我们提供了Countess™ II和Countess™ II FL全自动细胞计数仪。

初代Countess™仪器计数后死机，表明.csv文件已满，需要进行清理。.csv文件只能维持500行的数据，所以根据您使用仪器的次数，需要定期清理.csv文件，确保其计数后不会死机。以下为清理.csv文件的指导原则。在清理.csv前，记得将CVS中所有需要储存的数据转存到U盘中。

1. 不放入载玻片进行计数
2. 按下Save（保存）按钮
3. 按下View .CSV File b（浏览.CSV文件）按钮
4. 插入U盘按下Save to USB（另存到U盘）
5. 按下Close（关闭）按钮
6. 按下Start .CSV File（启动.CSV文件）按钮，随后会出现如下提示：“This action will erase the previous .CSV file and start a new one. All data files saved will now be added to the new .CSV file.（此操作将会清除以前的.CSV文件并新建一个.CSV文件。所有储存的数据文件将会添加到新的.CSV文件中。）”
7. 按下Continue（继续）按钮
8. 现在按下View .CSV File（浏览.CSV文件）按钮确保文件已经被清除。

• 首先，检查设置是否改变（大小，circularity，敏感度），将他们设回原来默认值。其它用户可能将其改动过。
• 第二，确保您的细胞大小是在实验设计范围之内（5-60 μm）
• 最后，不要将细胞直接上样处理；在您放上载玻片后，让细胞多沉淀几分钟。成像前，这一操作可使大部分细胞置于相同的焦平面上。
• 此外，您可以在计数后使用“放大图”按钮来看Countess如何计数细胞。活细胞被圈为蓝色，死细胞被圈为红色，黑圈包围的对象将会从计数结果中排除掉。如果无法进行细胞计数或者无法准确区分活/死细胞，可尝试调节设置和焦距，重新进行计数。

您使用测试珠时，我们推荐对珠子储备液进行高速涡旋震荡30s，之后吸取10 µL直接加入10 µL台盼蓝。对珠子和台盼蓝混合物反复上下吹打，确保混合均匀，之后立刻将10 µL样品加到载玻片上。珠子快速沉淀，会影响浓度。您可以同时观察珠子图像以确保所有出现在Countess™屏幕上的珠子都被计数算法计算在内。