细胞结构和分析：ICC，IHC和IF支持 - 入门

如要封闭细胞或组织，可以使用2-5％的牛血清白蛋白（第五组分，脱脂BSA）或是与二抗宿主种属相匹配的5-10％正常血清。其他选择还包括BSA和血清或其他纯化蛋白的混合物。我们提供一种没有种属特异性的即用型封闭液，即BlockAid™封闭液（货号B10710）。对于细胞或组织样品，要避免使用脱脂奶粉作为封闭剂，因为它含有大量的磷蛋白、组蛋白和生物素。

醛类固定剂（例如甲醛、戊二醛）可与各种细胞成分交联，这有助于保持蛋白质和细胞的形态。但一些抗原可能会因交联而被掩藏，需要通过抗原修复的方式暴露掩藏的抗原结合位点。此外，醛类固定剂需要通过通透处理使抗体进入细胞。甲醇和丙酮等有机溶剂可凝聚蛋白质并通透细胞，但细胞形态会受到破坏。表面抗原无需固定即可标记。

进行细胞和组织标记显微检测的最佳浓度为1-10 µg/mL，进行流式细胞术的最佳浓度为0.2-5 µg/mL。最佳浓度需通过试验确定。

放大抗体检测效果的常用方法是生物素-链霉亲和素检测，使生物素化的二抗结合偶联染料的链霉亲和素。该方法能够将信号放大约2-8倍，但在此之前必须先封闭内源性生物素。另一种方法是使用酪胺信号放大技术，将辣根过氧化物酶偶联物与染料标记的酪胺配合使用。该方法能够将信号放大约10-20倍，但在此之前必须先封闭内源性过氧化物酶。最后一种方法是使用Qdot™纳米晶体抗体或链霉亲和素偶联物，根据Qdot™颜色，该方法可产生高于标准有机染料偶联物40倍的信号。

访问细胞结构成像页面，可帮助您尝试选择最佳的细胞器标记染料和试剂。我们的细胞染色模拟工具也很有帮助，可以提供模拟细胞图像的示例，帮助您挑选试剂。

DAPI是一种非常普通的蓝色核复染荧光染料，能对固定和通透的细胞和组织的细胞核进行非常明亮的标记。遗憾的是，人们普遍认为它是介于半通透性到非通透性之间的染色剂，对活细胞的染色效果也不一致。Hoechst™ 33342染料是细胞通透性染料，与DAPI染色有相似的染色结合机制和荧光颜色；它是活细胞成像的首选，且对固定细胞的标记效果和DAPI一样好。

如果进行活细胞成像，CellMask™ 质膜染色剂染色最均匀，被细胞内吞的速度最慢。如果想固定和通透细胞（如进行抗体标记），这种产品并不是最佳选择。麦胚凝集素（WGA）偶联物也能标记活细胞，或者甲醛固定的细胞。它们可以在随后的去垢剂（如Triton™X-100）通透处理后保存下来。但如果细胞已经进行通透处理，WGA也会标记内部结构。因此，如果细胞已通透，则只能使用靶向质膜蛋白的抗体。亲脂性花青染料（如DiI）会标记活细胞的所有膜结构，而不仅仅是细胞质膜。此网页的内容可帮助您进行选择。

首先，在染色和洗涤步骤，确保您的细胞维持在在有利于保持其活力的条件下，包括维持最佳的温度、CO2百分比以及培养基/缓冲液比例——但并非所有的试剂和实验方案都可采用这一方法。其次，优化您的染料浓度和染色时间。您当然希望维持尽可能高的浓度和尽可能长的染色时间，从而能够得到高性噪比，但浓度越高、染色时间越长，试剂对细胞功能和活力的不可预知影响越大，非特异性背景也就越高。

一些类型的细胞会积聚酚红，阻碍使用荧光探针。酚红会淬灭可见光波长范围内的染料。此外，尽管酚红本身并不发荧光，但其中的各种杂质可能会发出荧光。我们有许多不含酚红的培养基可供选择。我们的活细胞成像溶液（基于HEPES）和FluoroBrite™ DMEM已经过优化，不含酚红且无自发荧光。

血清是维持一般细胞健康和功能的必要成分，一些细胞对血清非常敏感。遗憾的是，许多染料会结合血清中的不同成分，从而限制细胞摄入染料。此外，一些血清表现出酯酶活性，会裂解乙酰染料（例如钙黄绿素、AM、FDA等），阻碍其被动扩散进入活细胞。我们的常规建议是，如果您的目的细胞在染色孵育时能耐受短时的无血清环境，最好在无血清培养基或缓冲液中染色。染色完成后，可以再把细胞移回含血清培养基中。如果您的细胞无法耐受无血清环境，则可能需要增加染料浓度，补偿染料与血清成分的非特异性结合。对于乙酰化染料，可尝试使用加热处理的血清，或测试血清的酯酶活性。

大多数培养基都含有酚红，会淬灭可见光波长范围的荧光染料。大多数培养基还含有自发荧光成分——如核黄素——会降低信噪比。我们提供的FluoroBrite™ DMEM和基于HEPES的活细胞成像溶液已针对荧光成像应用进行了优化。此外，我们还提供多种不含酚红的培养基。但是，如果这些产品都不是您的试验的合理选择，为此我们还提供BackDrop™ 背景抑制剂 ReadyProbes™ 试剂，将其加入可淬灭培养基的自发荧光。

染料需要发光成像，在此过程中它们会淬灭或“光漂白”，导致荧光不断变暗、检测效率不断降低。抗淬灭封固剂可以大幅减少光漂白现象。如果您想标记活细胞，可使用ProLong™ Live抗淬灭试剂。如果您想标记后立即封固细胞，然后立即成像并丢弃样品，可采用SlowFade™ Diamond 抗淬灭封固剂，因为其可以保持液态并有良好的折射率。如果您想封固样品后存档样品，ProLong™ Diamond 抗淬灭封固剂会固化以获得更好的折射率，且可存档样品长达数周乃至数月。与其他抗淬灭封固剂不同，此类产品非常适合对荧光蛋白质进行即时成像（无法进行荧光蛋白质存档），并且有含或不含DAPI两种包装规格。更多信息请见此处。

首先，您需要确定自己的成像系统配备的滤光片组、光立方或激光波长，因为这些因素决定着您的波长选择。通常，滤光片组都以包含这些波长的染料命名（例如，“FITC” 滤光片组适于荧光素、Alexa Fluor™488、GFP和其他多数“绿色”染料）。其次，您应该搜索一下这些波长范围内的染料选择及其光谱，了解那些染料与滤光片规格的重叠程度。最后，要使染料的光谱彼此尽可能分开，以减小滤光片组间重叠的几率。通常，不同染料的其他特性会有所不同。例如，Alexa Fluor™ 488染料比荧光素光稳定性更强，对 pH更不敏感。我们的在线荧光光谱查看器工具能帮助您比较多个染料的光谱，并将其与您的滤光片组或激光特性相比对。