细胞结构和分析：ICC，IHC和IF支持 — 疑难解答

原因可能很多，包括封闭不足、一抗或二抗浓度过高或一抗或二抗降解。通过“无一抗”对照加以确定是否是二抗的问题。否则，我们建议你们尝试更严格的封闭或更低浓度的一抗或二抗。

首先，在所有滤光片下检查未染色/未标记的组织，确定这些信号不是由于内源性自发荧光引起的。这一问题在石蜡切片中尤为明显。如果对照仍然显示这是自发荧光，那么可以在封闭和标记前以1mg / mL硼氢化钠洗涤3×10分钟进行还原。

这种二抗非特异性结合的现象可能是由染料电荷引起的，例如带负电荷的染料被带正电荷的细胞组分吸引。为了阻止该现象，使用Image-iT™ FX Signal Enhancer（货号I36933和R37107）能够抑制结合物上的染料与细胞组分之间的电荷作用，进而阻断非特异性结合。

我们建议您尝试利用单色对照用错误二抗检测一抗，反之亦然，以检查是否存在跨物种标记。结果应该是阴性的。检查二抗产品手册中的交叉吸附种属说明，以确保该二抗与其他种属一抗交叉吸附过。另一种可能性是染料的光谱渗滤到其他波长。单色对照（配对正确）可用于检查此现象。

包括抗体在内的一些标记亲和力较低，它们会在标记载玻片的储存期间随时间而变弱。为了减缓这种解离速率，可以在加入二抗后将样品用甲醛5-15分钟固定，，用交联的方法将二抗固定交联。也可以用固化封固剂（如ProLong™ Diamond Antifade Mountant）封固样品，因为固化封固剂可以减缓二抗的扩散。最后，封固剂完全固化之后载玻片应低温保存（最好是-20 ℃），从而进一步减缓解离。

不管何种活细胞指示剂染料（如钙指示剂，pH指示剂，金属离子指示剂），请务必确保上样过程中无血清，否则血清会过早地切割带有AM酯基的染料并非特异性结合染料。在检测样品之前，请使用阳性对照优化染料浓度和染色时间来得到最佳的信号与背景比值。做阳性对照时缓冲液一定要包含已知浓度的自由离子和用于打开离子通道的离子载体（例如Fluo-4 AM一类的钙指示剂，它包括缓冲液中加入钙与卡西霉素，又比如pH指示剂，不同pH值的缓冲液与尼日利亚霉素相结合）。类似于CellROX™ Green 或H2DCFDA需要一个细胞活性氧（ROS）刺激作为阳性对照，例如甲萘醌。最后，确保成像系统具有灵敏的探测器。例如相对于显微镜或流式细胞仪，读板仪检测信号和背景差异的能力就比较低。

无论您使用哪种染料，四甲基罗丹明甲酯（TMRM）还是MitoTracker™ Red FM，未处理的细胞都会发出荧光。只要细胞线粒体膜电位降低就会导致荧光信号降低。最重要的是变化的程度。JC-1染料不仅强度改变，还有激发和发射比例光谱的改变。设置未处理的对照和用线粒体膜电位去稳定剂（如CCCP或FCCP）处理的阳性对照是非常重要的。这些染料仅用于活细胞，在固定处理的细胞中无法保留相同程度的信号。

当细胞和组织经由二甲苯或丙酮之类的溶剂处理时（例如组织切片脱石蜡期间），它通过阻止鬼笔环肽结合的方式来影响F- actin。冰冻切片通常不使用有机溶剂洗涤，可以用来代替石蜡切片，也可以使用抗肌动蛋白抗体。

当它们暴露在吸收波长强光下时，所有的荧光染料都会在一定程度上出现褪色或“光漂白”现象。这里列有一些光漂白的原因以及解决方案：

这里是一个很好的抗淬灭剂选择指南。

首先，确保在适当的波长中激发和检测染料。接下来，尝试优化对照的染料浓度和染色时间。我们的手册有一些指导。如果您使用的是活细胞系统，对于我们的许多产品，我们还建议洗去未反应的染料以减少背景荧光，或通过背景抑制试剂如 BackDrop™ Suppressor ReadyProbes™ Reagent抑制背景。请检查您的仪器设置；例如一些读板仪可通过调整增益设置的手段，以获得最佳信噪比。最后，一些染料在离子变化程度检测方面比其他染料好。如果想了解如何选择染料，可发送邮件至LifeScience-CNTS@thermofisher.com联系技术支持。

有以下两种方法来去除气泡：

1. 吸取少量你们要使用的ProLong™ 抗淬灭封片剂（少许过量）于离心管中。盖上盖子并置于离心机中离心（转速7, 000到13,000 rpm）。此时气泡会移动到样品顶部，通过移液枪/枪头即可移去气泡。
2. 拧松ProLong™ 抗淬灭封片剂的瓶盖，但不要打开。将整瓶/管放入真空瓶中，使用抽气龙头（抽气龙头T型管）。打开真空（水随龙头流走）并对混合液抽真空10到20分钟。

为了避免在样品中形成气泡或去除气泡：

1. 吸取适量的ProLong™ 抗淬灭封片剂封片之前可以将吸取体积调高一点。吹打混合液时不要把全部液体都吸上来，枪和枪头向上离开瓶子的时候体积不要满。这样做可以防止气泡进入枪头。
2. 使用盖玻片时出现气泡：当把盖玻片放于ProLong™ 抗淬灭封片剂上封固时，将盖玻片抬起一个小角度后再轻轻放下。如果盖玻片离样品平面过近或是放下过快，都有可能出现气泡。
3. 组织中出现气泡：组织切片，尤其是冰冻切片的一个问题是，空气往往会困于切片中或切片下。在封固时没有发现气泡，但是随着封片剂变硬，对样品轻微的挤压就会放出其中的空气。这使得切片中形成部分微小气泡，封于封固剂中。为了避免这种情况，封固之前先进行脱气。将切片浸没在缓冲液或封闭液中，然后放入真空泵上抽真空。这样就会把切片上的空气和缓冲液抽去。将切片从脱气缓冲液中移出然后封固。 
4. 如果ProLong™抗淬灭封片剂封固样品时快要凝固但是出现了气泡，你们可以把玻片放入PBS中（装有PBS的Coplin jar或Petri dish）。ProLong™抗淬灭封片剂会膨胀而盖玻片会滑落，或者你们也可以用手轻轻移开盖玻片。你们可以用新的小份的ProLong™ 抗淬灭封片剂重新封固。

首先，确保您同时拥有一个阴性（未处理）和一个阳性（ROS诱导）样本进行比较。100 µM甲萘醌1小时或是50 µM奈法唑酮24小时可以作为很好的阳性对照。H2O2 虽然不能很好地与CellROX™染料兼容，但也可以用于阳性对照。某些如H2DCFDA的染料需要酯酶切割，所以不能在血清（血清中包含的酯酶可过早切割染料）存在的情况下进行培养。如果您的阳性对照相对于阴性对照没有明显变化，尝试着增加染料浓度和标记时间。我们的实验指南给出了启动建议。进行活细胞成像时尽可能得快。只有两种染料（CellROX™ Green和CellROX™ Deep Red）经甲醛固定处理后能保留在样品中。最后，确保您使用的滤光片和仪器设置与染料的激发和发射光谱相匹配。