流式细胞术支持 — 疑难解答

如果明显是仪器问题，请附上您的仪器序列号发邮件至仪器服务部门lifescience-CNTS@thermofisher.com。如果是软件或者应用相关问题，或者您不清楚问题的原因，请发送邮件至细胞分析技术支持部门lifescience-CNTS@thermofisher.com——请在邮件的主题行输入“flow”或“Attune” 以确保邮件能够顺利投递。

请发送邮件至细胞分析技术支持部门(lifescience-CNTS@thermofisher.com)，请在邮件的主题行输入“flow”或“Attune”以确保邮件能够顺利投递。请在邮件中描述您的应用类型，实验方法以及结果，最好能提供得到数据的样品供我们分析。

我们建议查看箱子内部，可能在缓冲液袋下方。

打开Attune™ NxT软件，打开主菜单，进入“仪器”选项。最左边的选项是“系统日志”。点击该选项，即可打开日志文件。页面的底部有一个标有“导出”的按钮。使用该按钮可导出并保存日志文件。

有许多因素会引起样品率高：

• 可能流动细胞中有气泡
• 阙值水平可能设置的太低
• 阙值参数的PMT电压可能设置的太高
• 样品浓度可能太高
• 样品流速可能过高
• 样品可能被细菌污染

有许多因素会引起样品率低下：

• 系统可能堵塞
• 阙值水平可能设置的太高
• 阙值参数的PMT电压可能设置的太低
• 样品可能被过分稀释或是没有充分混匀
• 样品注射器可能松动

我们的抗体依照FDA规定分为三类：

• 体外诊断(IVD)产品通过临床应用验证。它们需要使用特定的实验方案以获得经过验证的实验结果。
• ASR产品经验证能够结合特定靶标，但没有经过验证的实验方案。在临床环境中，用户在使用这些抗体前必须验证自己的实验方案。我们不对这些产品提供实验方案信息。
• 仅供研究使用（RUO）产品面向普通用户，且没有经过临床应用验证。

抗体浓度有时会在网站上公布或印在标签上。如果在这些地方找不到，请查看分析证书（COA）。COA可以在产品页面的底部、参考文献正上方找到。如果COA上没有抗体浓度或者找不到COA，请发送邮件至细胞分析技术支持部门邮箱lifescience-CNTS@thermofisher.com。

确定与您的细胞类型结合的抗体的最好出处是专业文献。看看你的同事在用什么，然后看看我们是否有这些抗体。

您应该加入约100 µL的细胞。为此，方法之一是分装正确数量的细胞（10E6），然后离心去上清。残留体积大约为100 µL。

进行补偿时，你需要为自己使用的每种颜色参数准备单一染色样品（或补偿微球）。此外，我们建议您使用FMO（荧光扣除）对照。您可以使用减去一种颜色的其他所有颜色标记您的细胞或者微球来作为对照。为各种颜色准备FMO对照。这些对照对正确设置数据门限很有帮助。

不一定。许多用户使用未染色细胞结合FMO对照，来确定他们的阳性群体。

通过运行单色对照，有可能除去溢出到另一个荧光采集通道的荧光信号。

这是可能的。但是如果您的值超过100，可能需要查看你们用来采集数据的电压。

首先检查您的阈值，看它是否设置为前向散射。如果是的话，微珠可能被阈值排除。降低阙值设置后，应该就可以显示出您的微珠了。

该公式是让您用计数区域的细胞数除以分析的微珠数。该值随后乘以你们加入的微珠数。该试验方案要求加入50 µL微珠，并且微珠的包装瓶上列出了每50 µL所含的微珠数量 - 你们要乘以该数值（不要除以50）。最后，将得到的结果除以1000即是细胞数/µL。

不可以，当细胞与微珠结合时，所得的数据并不理想。您需要通过Dynabeads™ 试验去除细胞上结合的微珠，从而进行下游分析。适于这一类应用的检测体系包括Dynabeads™ FlowComp™ 检测和DETACHaBEAD™检测。

有关流式细胞术抗体组合设计的内容，请参阅我们最新的Molecular Probes流式细胞术抗体组合设计工具。该设计工具可通过几个简单的步骤，帮助您选择适合自己的流式细胞术抗体组合的荧光标记抗体：挑选抗体种属反应性，选出14个目标靶点（包括活性染料），然后选择激光或者你想要观察的荧光团。

用胰蛋白酶或其它试剂处理细胞使贴壁细胞分离，会造成膜损伤，从而使这类细胞被膜联蛋白Ⅴ标记。避免出现这一问题的最好方法是将您的细胞放回培养箱中30-45分钟。每隔几分钟涡旋管/板/瓶以防止细胞再次附着。在此恢复期之后，就可以用膜联蛋白V标记您的细胞并进行流式细胞术分析。

许多因素影响着细胞周期曲线的质量。细胞数、染料浓度、孵育温度、孵育时间、流速（在利用流体动力学聚焦的传统流式细胞仪上处理时）、获得细胞的总数、死细胞排除以及从数据分析中除去聚集体等，都需要在分析细胞周期时考虑到。

用CellTrace™试剂绘制出好的传代曲线的关键是在开始时均匀标记细胞，使它们在标记零点有紧密的变异系数（CV）。如果峰太宽，迭代相互重叠，一系列峰将成为一个驼峰。由于染色程度与细胞大小成正比，可以从统一的细胞群（而非淋巴细胞和粒细胞等混合的细胞群）开始标记，实现均匀的标记。细胞标记时间很短，所以您需要预先稀释染料，迅速混入你的细胞。请确保您的细胞未沉积在试管底部。实现这一点最简单的方法就是准备一份2X染色液（1×= 1-10μM），在一半体积（无血清或BSA）培养基中重悬细胞。将染料添加到细胞中并倒置几次以混合。染色过程中轻轻晃动细胞。染料孵育结束后（20分钟，37℃）即添加血清或BSA（至少1％），以清除任何残留的未反应染料。离心细胞，洗涤一遍，然后在完全培养基中重悬。经10-20分钟的脱酯化孵育后，细胞即可用于你们的实验。一定要确保有一个零点对照，因为您需要知道细胞第一次传代的时间。

许多抗体和染色剂会标记死细胞。如果您不把死细胞从分析中排除，相关数据将受到干扰。当然，如果你标记的是固定细胞，由于其本身已经死亡，就不再需要添加活性染色剂。但是，如果你们在固定前标记细胞，就需要使用LIVE/DEAD™ 固定死细胞染色剂。

Indo-1，AM流式细胞仪的首选染料。它更适用于单激光激发（通常使用351-364 nm的氩离子激光的谱线），可监视两个发射。Indo-1的最大发射从在无Ca2+培养基中的〜475 nm变为Ca2+饱和的〜400 nm。Indo-1，AM是特别适用于多色荧光应用。

ROS活性只能在活细胞中测量。固定的细胞不再存活。

效果不好，因为该试剂盒中的染料也会染色哺乳动物细胞。您可以根据散射特性区分细胞，但是染色剂无法验证您的选择。

您可以用BacLight™ Green细菌染色剂（货号B35000）或BacLight™ Red细菌染色剂（货号B35001）等常规染色剂进行细菌染色。你们可以看到革兰氏特性（货号L7005），细胞存活率（货号L7007、L7012和L13152），细胞计数（货号L34856和B7277）和细胞活力。细胞活力可以通过膜电位法（货号B34950）或代谢法（货号B34954和B34956）测定。