化学标记支持 - 入门

是的，只要目标分子具有与可用的标记产品合适的反应基团。如果您的分子没有适合于我们的多种反应标记物的合适反应位点，请参考题为“HPLC的衍生化方法手册”的文章，了解其他标记选择。

共价修饰之后，相对于没标记的分子，经过标记的分子功能可能发生了改变，须通过经验来判定其可被接受的功能和本底水平。

• 待标记的分子：
  • 必须含有合适的标记位点，例如：伯胺、硫醇、羧基、磷酸盐等
  • 在反应溶液中必须可溶和稳定
  • 在分离标记与非标记分子过程中，必须经得起某些形式的反应后纯化。反应后的纯化可采用分子体积排阻色谱、透析、HPLC、电泳或其他适当的方法。

• 反应标记物必须容易接触到结合位点。
• 分子上的目标反应位点不可以有竞争位点。例如，如果使用碳化二亚胺-激活（例如使用EDAC，CDC）羧基法结合氨基末端的标记，则被标记分子中不应该含有任何易接触的磷酸盐，因为磷酸盐同样可以在此条件下激活并被标记。

你必须清楚自己的分子、肽段或蛋白的结构，了解哪些位点适合标记以及标记的目的位点容易接触到标记反应试剂。避免共价修饰酶分子的活性位点或其他分子内的重要功能区域。例如，如果一个多肽的羧基末端对于其结合能力或其他功能是必须的，则应避免将染料偶联到羧基基团或其他C末端附近位置。

不能。对于大分子来说，可能含有多个标记反应位点（例如蛋白表面的赖氨酸），用胺反应试剂的标记属于“鸟枪法”或随机法标记。不可能控制偶联的位点，终产物将会是标记于整个蛋白表面不同位点的标记蛋白混合物。

• 首先，选择一个与你仪器上的光源和滤片/通道匹配的荧光团，以保证合适的激发和发射水平，并确保能够被充分检测到。
• 第二，了解自己的分子的性质。您的分子是亲水、疏水，还是整体阳离子或阴离子？您可能希望将疏水的分子标记上疏水的染料（例如我们的BODIPY™染料）来保持分子的整体疏水性。如果你有一个内在阳离子肽或者其他分子，你可能希望结合上一个阳离子罗丹明染料。如果这个分子是大分子阴离子，可使用阴离子染料，如荧光素或某些Alexa Fluor™染料。
• 第三，测定适合您的分子标记位点和范围。例如，使用一个量子点（Qdot™探针）结合于完整抗体（SiteClick™试剂盒）的Fc部分，相对于使用有机染料结合于抗体表面的任何部位要更好。如果在抗体的抗原结合位点上或附近含有赖氨酸，标记上胺反应染料可能会导致抗体失效。

我们强烈建议您测定DOL。DOL可通过测定260 nm（用于核酸）或280 nm（用于蛋白）处的吸光度读数加上荧光团最大吸光度测得。仅仅通过吸光度读数，就可以测定标记反应是否成功，并且如果今后要对相同分子进行后续标记，DOL测定能够确定这种分子最佳标记程度。

荧光检测不能判定分子是否标记以及过度标记——所有的这些标记情况可能产生同样水平的少量荧光或无荧光。使用某些染料，过度标记会导致染料间的抑制，导致无法检测到荧光，但是可通过吸光度检测法检出。同样，目测标记分子的溶液颜色也不可用于判定其是否适当标记。

对于生物素标记的分子，可以通过使用HABA试验或其他类似试验（参见FluoReporter™ Biotin Quantitation Assay Kit，货号B30751）进行DOL的测定。

荧光团偶联分子的信号丢失的原因多种多样，具体取决于丢失是否由分子性质或附在分子上的荧光团造成。结合不佳或者无标记分子相关的高的结合/剥离速率，都可能导致信号很弱。蛋白或其他分子可被蛋白酶消化，形成后续的产物包含小的荧光团结合的肽或者氨基酸，可能变得太分散从而难以检测或冲洗掉。相比于未标记的分子，有些应该标记的分子可能会被活细胞大量的泵出细胞外。

结合在目的探针上的荧光可能会发生光漂白、淬灭或降解。一些显色染料（例如酚红，台盼蓝）、二甲苯或其它试剂的存在会瞬间淬灭一些荧光素；一旦移除这些成分后，荧光素依旧会发荧光。而光漂白、氧化、还原或其他因素则可导致荧光素发生不可逆地降解。请避光储存，避免接触极端pH、强氧化或还原试剂、重金属；对于荧光蛋白，例如GFP或藻胆蛋白（R-PE, APC），避免任何可促使其消化（如蛋白酶）、去折叠、变性的因素。