Dynabead细胞分离与扩增支持 - 入门

我们提供三种不同大小的Dynabeads™磁珠：1微米的磁珠（在产品名称中搜索Invitrogen™ MyOne™磁珠），2.8微米的磁珠和4.5微米的磁珠。通常情况下，每毫升磁珠的结合能力和结合动力学参数随着磁珠尺寸的减小而增大。

这要视您的具体应用而定。一般来说，4.5微米的磁珠最适合细胞分离和激活/扩增。这些较大的磁珠具有更高的磁流动性，而且尺寸上与哺乳动物细胞近似，因而不大可能被细胞吞噬。较小的1微米磁珠和2.8微米磁珠通常用于分离核酸或蛋白，或用于免疫沉淀实验。阴性分离细胞试剂盒中通常使用1微米的磁珠，因为它们具有更高的每毫升结合能力和更快的结合动力学。在阴性分选过程中，细胞对磁珠的吞噬不会成为问题，因为用户只需对剩余的细胞群体进行观察。用二抗，蛋白A或蛋白G，或链霉亲和素包被的2.8微米Dynabeads™磁珠，配合使用自选的一抗，靶向结合特异性的细胞表面抗原，也可应用于阳性细胞筛选。

Dynabeads™磁珠的密度约为1.5 g/cm3。

通常情况下，1毫升成年人血中包含： 

~5 x 10E9个红细胞 

~7 x 10E6个白细胞

~3 x 10E8个血小板

在7 x 10E6个白细胞组份中，包含：

4 x 10E5个单核细胞

1 x 10E5个NK细胞

淋巴细胞：

        2 x 10E5个B细胞

       1 x 10E6个T细胞（约70%为CD4+ T细胞，30%为CD8+ T细胞）

          粒细胞：

        5 x 10E6个嗜中性白细胞

       2 x 10E5个嗜酸性细胞

       4 x 10E4个嗜碱性细胞

白细胞层，即白细胞浓缩层，是对抗凝血样进行离心（不使用例如Ficoll^™溶液等密度梯度试剂）后获得的中间层组份，位于血浆下方，红细胞上方。白细胞层同时含有白细胞和血小板，因此可作为这些细胞材料的来源。

MNC也称为外周血单核细胞（PBMC），是从全血、白细胞层、骨髓或脐带血中通过密度梯度离心分离出来的。下面介绍了用于阳性分离或去除法实验方案的标准MNC制备实验方案

1. 收集含抗凝剂（EDTA，ACD，肝素）的血样。分别按照外周血1+1，白细胞层1+2，骨髓1+1和脐带血1+3的比例，使用PBS （含0.1% BSA+ 0.6%柠檬酸钠或2 mM EDT）进行稀释。
2. 取一个50 mL离心管，将35 mL稀释后的样本加在15 mL梯度介质（如Ficoll™或Lymphoprep™溶液）上层。
3. 在18–20°C条件下以400 x g离心30-40分钟。如果血液保存时间超过两小时，则再增加10分钟离心时间。
4. 收集中间层中的MNC，并将这些细胞移至50 mL离心管中。
5. 使用含0.1% BSA的PBS 洗涤MNC三次，其间通过2–8°C300 x g离心8分钟的操作来沉淀细胞。
6. 使用含0.1% BSA的PBS溶液将细胞重悬至1 x 10E7个细胞/毫升，并冷却至2–8°C。

如下图所示，MNC中包含T细胞（50%），B细胞（5-10%），NK细胞（5-10%）和单核细胞（30%），极少量的血小板且不含粒细胞。

如后续需要使用非接触式/阴性分离试剂盒，则推荐使用下列方案来制备低血小板含量和最高纯度的MNC：

可使用全血/白细胞层和骨髓样本作为起始样本。

1. 在18–25°C条件下使用PBS （含0.1% BSA+ 0.6%柠檬酸钠或2 mM EDTA），将10-18 mL血液/白细胞层样品稀释至35 mL。
2. 将稀释后的血液/白细胞层样本加至15 mL梯度介质（如Lymphoprep™或Ficoll™溶液）上方。
3. 在20°C条件下以160 x g离心20分钟。离心结束后逐渐减速而不要骤然停止。
4. 去除20 mL上清液，以减少血小板组份。
5. 在20°C条件下以350 x g离心20分钟。离心结束后逐渐减速而不要骤然停止。
6. 从血浆/Lymphoprep™溶液的中间层收集MNC，并将这些细胞移至50 mL离心管中。
7. 使用含0.1% BSA的PBS洗涤MNC一次，通过2–8°C下400 x g离心8分钟来沉淀细胞。
8. 使用含0.1% BSA的PBS洗涤MNC两次，通过2–8°C下225 x g的离心8分钟来沉淀细胞。使用含0.1% BSA的PBS，以1 x 10E8个MNC/毫升的密度重悬MNC。

使用酶解消化和机械破碎等标准组织处理方法来制备单细胞悬液。通过细胞筛或30 µm滤网对消化后的细胞悬液进行过滤，以减少大块的聚集物。组织破碎通常会导致部分细胞死亡并释放出DNA。游离DNA会降低细胞捕获效率，回收率和纯度。DNase I处理的方法是：在18–25°C条件下将细胞悬液与含0.1% BSA + 1 mM CaCl2 + 0.5 mM MgCl2的PBS溶液以及120 Kunitz单位DNase I/mL共同孵育30分钟（对于CELLection™产品，需要在加入磁珠前对细胞进行洗涤以去除DNA酶）。

加入Dynabeads™磁珠之前需对骨髓进行洗涤和稀释，以降低样本粘性。在制备骨髓细胞的过程中，推荐在使用Dynabeads™磁珠分离细胞之前，对样本进行洗涤和DNA酶处理：

1. 将2 mL（10E7-10E8个细胞）骨髓样本与2 ml PBS w/ 0.1% BSA + 0.6%柠檬酸钠溶液进行混合。
2. 在18-25°C条件下以600 g离心8分钟。
3. 弃去上清，再使用5 mL 含0.1% BSA + 1mM CaCl₂ + 0.5 mM MgCl₂的PBS进行重悬。
4. 加入600个Kunitz单位的DNase I（120个Kunitz单位DNase I/毫升）。
5. 在18-25°C条件下孵育细胞30分钟，期间不断地进行轻柔的倾斜和旋转。
6. 在18-25°C条件下以600 g对细胞悬液离心8分钟。
7. 弃去上清，在5 mL含0.1% BSA的 PBS 中重悬细胞。
8. 在18-25°C条件下以600 g对细胞悬液离心8分钟。
9. 弃去上清，使用RPMI 1640 / 1% FCS将细胞重悬至1 x 10E8个细胞/毫升的浓度。

通常情况下，冻存培养基（10% DMSO和90% FCS）或Gibco™ Recovery™细胞冻存培养基（货号12648-010）的使用效果都很好。冻存过程中总有一些细胞会发生死亡。此外，冻存和复苏过程可能会造成某些细胞的裂解。请按以下步骤使用Gibco™ Recovery™培养基冻存哺乳动物细胞：

1. 化冻Recovery™细胞冻存培养基，彻底混匀后在2–8°C放置，直至使用。
2. 对于悬浮细胞从步骤3开始操作。对于贴壁细胞而言，用户应使用Gibco™ TrypLE™试剂等适当的解离试剂，将细胞从其生长基质上轻柔地解离下来。使用该细胞的完全培养基重悬细胞。
3. 将细胞悬液移至15-mL的无菌离心管中。
4. 使用Invitrogen™ Countess™自动细胞计数仪（也可使用类似的自动或手动方法）确定活细胞的密度和百分比，并计算所需Recovery™细胞冻存培养基的体积，使最终细胞密度达到1 × 10E6至1 × 10E7个细胞/mL。
5. 100-200 × g离心细胞悬液5-10分钟。在无菌条件下倒出上清液，但不要扰动细胞沉淀。注意：离心速度和时间可基于具体细胞类型来进行调整。
6. 使用（2–8°C）冷却的Recovery™细胞冻存培养基，以基于具体的细胞类型而推荐的活细胞密度（通常为1 × 10E6个细胞/mL或更高）重悬细胞沉淀。
7. 按照生产商的技术说明（即在2 mL冻存管中加入1.5 mL悬液）将细胞悬液分装于冻存管中（应不时地轻柔混匀，以维持细胞悬液均匀）。
8. 使用自动或手动控制变温速率的冷冻装置，按照标准步骤执行细胞冻存操作（约每分钟降低1°C左右）。
9. 将冻存细胞移入液氮（气相）中，推荐保存于–200°C至–125°C。

在37°C水浴中对细胞冻存管中的细胞进行解冻，直至剩余一个小冰晶时取出。解冻后立即将细胞轻柔地转入10-15 mL的新离心管中，向细胞中逐滴加入10 mL 20% FCS/人血清，并温和的吹打。避免气泡产生并尽快完成操作。以200 x g离心细胞8分钟。弃去上清。在适当的缓冲液/培养基中重悬细胞。

我们推荐您按照样本体积来挑选磁力架：

• Invitrogen™ DynaMag™-2 Magnet（货号12321D）磁力架的工作体积：1 µl–1.5 mL的样本体积
• Invitrogen™ DynaMag™-5 Magnet（货号12303D）磁力架的工作体积：1–5 mL的样本体积
• Invitrogen™ DynaMag™-15 Magnet（货号12301D）磁力架的工作体积：4-15 mL的样本体积
• Invitrogen™ DynaMag™-50 Magnet（货号12302D）磁力架的工作体积：10-50 mL的样本体积
• Invitrogen™ DynaMag™-96 Side Magnet（货号123-31D）将磁珠吸附至每一孔的一侧。兼容PCR联管和96孔平板（200 μL），无裙边和半裙边的产品
• Invitrogen™ DynaMag™-96 Bottom Magnet（货号123-32D）：将磁珠吸附至每一孔的底部。兼容PCR联管和96孔平板（200 μL），无裙边和半裙边的产品

去除所有磁珠的最佳方法首先是将管体在磁力架上放置更长时间。之后非常轻柔地将上清液吸出，移至另一新的离心管中（请小心不要碰到管体两侧的磁珠）。可再次将上清液放置在磁力架上，以去除剩余的少量磁珠。

用下列试剂之一喷洗和/或擦拭DynaMag™磁力架，这些试剂经测试可用于清洁磁力架：

• 70%异丙醇
• 1%次氯酸钠溶液（漂白剂）
• 0.1 N HCl溶液

其他未经测试的消毒剂可能不适用。不要将磁力架浸没在水溶液中，也应避免长时间暴露于水或水溶液中。接触到强溶剂时使用湿布和柔和的清洁剂来进行清洁。不要对DynaMag™磁力架进行高压灭菌，当加热至70°C以上时，磁力架的材质会丧失稳定性，进而导致磁力减弱。

阴性分离，也称为非接触式细胞分离，是使用优化的混合抗体直接识别样本中的非靶标细胞类型，之后再通过磁珠分离法吸去抗体结合的细胞，从而将靶标细胞留在上清液中的分离方法。阴性分离法中所使用的Dynabeads™磁珠可通过链霉亲和素（如果混合抗体经过生物素标记）或二抗（如果混合抗体源于单一种属的宿主）来进行包被。阴性分离的工作流程如下图所示：

当细胞纯度是最重要指标，而无需顾及靶细胞的激活问题，或下游应用为分离RNA或gDNA时，推荐使用阳性分离法。当最重要的指标是尽可能减少对所分离细胞的干扰，以及下游应用包括细胞培养，研究细胞功能、形态和流式细胞术时，则推荐阴性分离法（请注意阳性分离细胞也可用于包括细胞培养、流式细胞术或细胞功能学研究等下游应用，不过由于阳性分离法中需要从细胞上释放磁珠，用户可使用例如FlowComp™产品或含有DETACHaBEAD™产品的阳性分离试剂盒完成这一操作）。

阴性分离的优点是分离迅速，而且分离得到的细胞未受干扰，因此不大会受到刺激。由于该方法十分柔和，因此分离得到的细胞活力高。阴性分离的缺点通常是需要以PBMC/MNC作为起始材料，而且获得的细胞纯度不及阳性分离那样高。

使用阴性分离法时，靶细胞的纯度可高达90%。

2X分散操作，也称为双倍分散操作，是一种能够提升靶抗原低表达细胞的清除效果的技术。该技术无需更多磁珠，但需要十分钟以上的时间来操作。向抗体包被的细胞中加入一半（50 μL）而非全部（以100 μL举例）Depletion Dynabeads™磁珠，进行孵育，之后将上清液（含靶标细胞）移至一个含剩余Depletion Dynabeads™磁珠（50 μL）的离心管中。孵育10分钟后，将上清液移至一个新离心管中。使用含双倍分散操作的阴性分离法能够提升细胞纯度。

不可以，PBS中不能含有Ca2+和Mg2+，因为二价阳离子会导致补体激活和细胞聚集。样品中发生细胞聚集会同时严重降低细胞得率和分离纯度。分离缓冲液中必须加入EDTA，以减少补体激活和细胞聚集效应。另一种选择是以0.6%的柠檬酸钠代替EDTA。

这些产品的回收率在73±10%，纯度可达93±3%。

阳性分离是一种从样本中分离单一特异性靶细胞群体的方法。通过使用靶标特异性抗体包被的Dynabeads™磁珠，磁珠只会与表面携带匹配抗原的靶细胞进行结合。用户可基于下游应用，在基于Dynabeads™磁珠的两种不同阳性分离法中作出选择。由于磁珠自身体积就很大（直径在1 µM至4.5 µM之间），因此我们不推荐您在任何类型的流式细胞仪中直接使用磁珠结合的细胞。因此，如果您需要开展下游的细胞学分析，并希望使用流式细胞仪，我们推荐您使用我们能够释放磁珠的阳性分离试剂盒。带磁珠释放操作的阳性分离试剂盒的工作流程概括于下图中（请注意：在某些阳性分离试剂盒中，抗体是与Dynabeads™磁珠直接相连的，因此在这类试剂盒中，前两步操作可省略）。另一方面，如果您希望将分离出的细胞应用于下游的分子研究，您无需从细胞上释放磁珠，可使用不含任何释放机制的直接交联的磁珠。

阳性分离法的主要优势为高纯度和高得率。此外，阳性分离法一般不需要初始的样本制备步骤，因为细胞可直接从全血、骨髓或组织消化产物等任何样品中直接被分离出来。如果使用一抗包被磁珠且无需释放磁珠，这一分离步骤就非常简单迅速；举例来说，您可在25分钟之内从全血样本中直接分离出细胞，同时可获得非常高的细胞活力。任何阳性分离法的普遍缺点为对细胞的潜在激活效应，这是由靶标细胞上靶抗原表位的功能来决定的。请注意Dynabeads™磁珠不会直接导致细胞激活效应；导致此效应发生的是抗体-细胞抗原表位之间的相互作用。当使用带有磁珠释放机制的阳性分离法时，必然会损失一定的细胞得率，因为细胞与磁珠之间的所有连接不可能被完全打断。

• 在细胞阳性分离操作中，我们推荐您在每mL样品中使用1–2 x 10E7总PBMC/mL，和1 x 10E7个Dynabeads™磁珠/mL样品。另一种确定所需磁珠用量的方法是，假设为每个靶标细胞提供4个左右的磁珠。
• 如果您希望去除样本中某一类靶标细胞，我们推荐您使用与上述情况相同的细胞浓度（1–2 x 10E7 总PBMC/mL），但至少将Dynabeads™磁珠的用量翻倍至2 x 10E7个Dynabeads™磁珠/mL样品。或者，假设为每个需去除的靶标细胞提供8-10个左右的磁珠。

注意：大多数用于细胞分离的Dynabeads™磁珠是以约4 x 10E8个磁珠/mL的浓度来提供的，因此1 x 10E7个微珠的体积仅有25 μL（请检查每一产品的特定产品手册或标签来进行确认）。

有三种方法可去除所分离细胞上结合的Dynabeads™磁珠。

• DETACHaBEAD™ 试剂盒（阳性分离）——解离试剂为抗Fab的多抗试剂，将磁珠结合的抗体从细胞上竞争性结合下来，从而帮助用户获得不含抗体和磁珠的细胞。提供适用于人CD4+和CD8+ T细胞，CD19+ B细胞和CD34+造血干细胞的试剂盒。
• CELLection试剂盒——解离试剂是一种DNA酶，能够消化抗体与磁珠之间的DNA接头，从而帮助用户最终获得不含磁珠的细胞。提供适用于人体EpCAM（Ber-EP4）上皮细胞和链霉亲和素（能够结合任一种生物素标记的抗体）的试剂盒。
• FlowComp试剂盒——解离试剂为生物素，能够竞争性结合与磁珠相偶联的des-生物素化抗体。提供适用于人类和小鼠总T细胞，CD4+和CD8+的T细胞亚群，以及人单核细胞的试剂盒。

使用DETACHaBEAD™试剂盒的主要优势为能够在细胞分离操作后获得不含抗体和磁珠的细胞。此外，所得细胞的纯度和活力高。但DETACHaBEAD™试剂盒只适用于少量人源细胞类型——每种产品只配备一种专用的DETACHaBEAD，因此该项释放操作无法实现普遍性。为了获得最佳得率，释放步骤需要在室温下进行45分钟左右。DETACHaBEAD™试剂会对分离后续进行FACS细胞检测造成影响，因此在释放操作后按实验方案要求对细胞进行洗涤十分重要。

DETACHaBEAD™试剂为抗小鼠的anti-Fab多抗产品，能够以高亲和力结合靶标抗体的抗原结合域，从而降低后者与细胞之间的亲和力。每一种DETACHaBEAD™试剂都针对一种特异性抗体的分离进行了专门优化。因此，我们不推荐您在试剂盒支持的细胞类型或Dynabeads™磁珠以外，使用DETACHaBEAD™试剂。DETACHaBEAD™产品不是结合细胞的游离抗体，只适合对磁珠结合的抗体进行解离操作。

不会，与Dynabeads™磁珠相偶联的Pan B抗体不会与小鼠B细胞或其他物种的B细胞发生交叉反应。

全血样本中包含的可溶性CD14，会与磁珠发生结合，从而减少能够与单核细胞上CD14抗原结合的位点，降低单核细胞的整体得率。

EpCAM抗原是一种上皮细胞粘附分子，在绝大多数上皮来源的细胞，以及上皮来源的肿瘤细胞上高表达。

CELLection™上皮细胞富集试剂盒所提供的磁珠上包被有Ber-EP4，该分子能够以高亲和力与上皮细胞标志物EpCAM（上皮细胞粘附分子）相结合。上皮细胞富集产品无法阳性分离循环肿瘤细胞（circulating tumour cells），但为科研人员提供了一种能够直接应用于全血、骨髓或MNC样本的高灵敏度富集技术。本产品基于健康（亦或无循环肿瘤细胞，circulating tumour cells）个体的血流中不存在上皮细胞的理论。因此，从血样中分离出上皮细胞是存在循环肿瘤细胞（circulating tumour cells）的一个重要提示，但还需凭借下游检测来进行确认。除上皮细胞外，一些白细胞也会被捕获或由于非特异性结合而被分离出来。不过这些白细胞的比例显著低于上皮细胞，该领域的研究者可通过肉眼简单地从上皮细胞富集磁珠共分离出的细胞中鉴定或分辨出上皮（肿瘤）细胞。5 mL血样中可能有1万乃至更多数量的白细胞伴随着上皮细胞被共同分离出来。所分离出的细胞应随即进行下游研究来（1）验证上皮细胞属性（如通过细胞角蛋白等进行免疫染色），之后（2）进一步针对所富集细胞进行肿瘤细胞的确认和鉴定。

Dynabeads™ FlowComp™试剂盒基于经修饰的生物素-链霉亲和素分离与释放技术。捕获抗体由DSB-X生物素进行标记，而Dynabeads™ FlowComp™试剂盒中的Dynabeads™磁珠则由修饰过的链霉亲和素进行包被。靶标抗体上的DSB-X生物素相比普通生物素而言，与链霉亲和素的亲和力更低。因此在阳性分离之后，用户可通过加入含有过量普通型生物素的解离缓冲液来释放细胞，这些普通型的生物素会从DSB-X生物素标记的靶标抗体上将Dynabeads™磁珠偶联的修饰链霉亲和素竞争性结合下来。其结果是，用户能够获得不含磁珠，但含有抗体的分离细胞（DSB-X生物素化的靶标抗体仍粘附在细胞表面）。

我们推荐用户使用FACS技术来检测细胞纯度。不过，由于靶标抗体仍粘附在细胞表面，我们推荐您使用另一种能够结合同一膜表面标志物上不同抗原表位的抗体。在产品附页中，我们会为FACS实验推荐最佳的适用抗体。

大多数人源FlowComp™试剂盒实验方案需要为一次测试准备5 x 10E7个（或以上的）细胞。您可尝试使用更少量的细胞样本，但我们不推荐您按比例减少Dynabeads™磁珠或缓冲液的体积；请将这些试剂的用量维持在5 x 10E7个细胞时的推荐用量。这一用法也同样适用于释放步骤，解离缓冲液的体积须大于500 μL，所以请确保不要将试剂用量缩减至推荐值以下。

不可以，使用我们在Dynabeads^™ FlowComp^™ Flexi试剂盒中所提供的生物素化模块非常重要，因为解离试剂（Release Buffer）只会竞争DSB-X生物素，而不会竞争普通型生物素。您可能会通过自备的生物素化抗体获得良好的分离效果，但您无法完成释放操作，除非使用我们在试剂盒中提供的DSB-X生物素化抗体。

不能，生物素结合剂和链霉亲和素Dynabeads™磁珠均包被了野生型的链霉亲和素，后者与DSB-X生物素之间的结合过于紧密，无法通过普通型生物素高效解离下来。

实验方案中指定的最低浓度为0.5 mg/mL。在内部实验中，我们不使用更低的浓度，但在偶联反应中增加DSB-X生物素的用量将有助于提升标记效率。可简单通过离心浓缩器（Centricon™滤柱）对抗体进行浓缩，而不影响抗体的生物学活性。

CELLection™试剂盒中包含了经DNA接头包被（可通过链霉亲和素或抗体用于细胞分离）的Dynabeads™磁珠，和一款用于释放磁珠的DNA酶。在使用磁珠（直接或间接地）捕获靶标细胞后，可通过DNA酶的处理来剪切DNA接头，以释放细胞。其结果是，靶细胞从Dynabeads™磁珠上解离下来，但仍与捕获抗体相结合。

我们提供了三种Dynabeads™ CELLection™细胞分离试剂盒：

• CELLection™上皮细胞富集试剂盒（货号16203）中包含了与anti-EpCAM单抗相偶联的Dynabeads™磁珠。
• CELLection™生物素结合剂试剂盒（货号11533D）适合应用您自备的生物素化抗体来对靶标细胞进行阳性分离
• CELLection™泛小鼠IgG试剂盒（货号11531D）适合应用您自备的小鼠IgG来分离靶标细胞

在通常情况下，Dynabeads™磁珠的尺寸很大，不会发生细胞内吞的现象。网格蛋白有被小窝通常不会大于500 nm，这对Dynabeads™磁珠的内吞作用来说太小了。不过，对于像单核细胞/巨噬细胞等具有吞噬活性的靶细胞而言，Dynabeads™磁珠还可能由吞噬作用介导进入细胞内部。

我们提供了多种不含释放机制的Dynabeads™磁珠，这些产品可用于细胞阳性分离（捕获靶标细胞）或去除操作（将靶标细胞从样本中去除）：

• 适用于细胞去除操作的Dynabeads™磁珠：通过Dynabeads™磁珠进行的细胞清除是一种十分快速、高效和方便的技术。选用预先包被的Dynabeads™磁珠，或使用您的自备靶标抗体来包被我们的二抗包被磁珠，将其加入样本（如全血、PBMC、白细胞层，组织消化产物），混匀并孵育20分钟，再置于磁力架2分钟，您就完成了细胞去除操作。
• 适用于阳性分离操作的Dynabeads™磁珠，可匹配分子水平的下游分析应用：不含磁珠释放机制的靶细胞阳性分离可用于DNA、RNA或蛋白分析等分子水平的下游研究。在这些应用中，当磁珠连着细胞时，可对分离的细胞进行裂解，当细胞裂解后，磁珠可被移除。如果体系中存在磁珠不是问题，您也可在磁珠存在的条件下培养细胞。在大多数情况下，2-3天后表面的抗原会发生内化，磁珠也会随之脱落——因为这些磁珠相对体积过大，而无法通过细胞内吞途径来实现内化。

在培养中细胞是否会内吞Dynabeads™磁珠要视具体细胞类型而定。由于磁珠尺寸的关系（通常直径为4.5 μM），Dynabeads™磁珠将不会通过内吞途径（例如通过网格蛋白有被小窝）发生细胞内化。网格蛋白有被小窝在尺寸上一般不会大于500 nm，这对于磁珠的内吞来说太小了。不过，如果细胞具有吞噬活性（如单核细胞/巨噬细胞），Dynabeads™磁珠还是可能在这些特定类型的细胞中被吞噬进入吞噬溶酶体的。所以您问题的答案可能为是或否——视具体的细胞类型而定。

外泌小体是微小的卵形或杯形膜结构，大小在30-150 nm，其中包含有mRNA，microRNA，蛋白和脂类。外泌小体可由正常，异常或肿瘤细胞释放进入血、尿、唾液和乳汁等体液中。外泌小体源于内吞型细胞器，并作为与质膜融合的多泡体（MVB）而从细胞释放出来(J Cell Biol 200:373 (2013)).

外泌小体被报道具有多种不同的功能，如抗原呈递、凋亡、血管发生、炎症和凝血作用，这些作用是通过蛋白/脂类交换或信号途径的激活来实现的。外泌小体提供了一种胞间遗传物质交换的全新机制，并能够介导细胞间的相互通讯。外泌小体也能够转运和传播传染性物质，如朊蛋白和逆转录病毒。

除沉淀法之外，外泌小体还可通过超速离心或密度梯度分离法实现分离。用户也可使用靶向外泌小体标志物（例如人源的CD9、CD63、CD81、EpCAM）的Dynabeads™磁珠或二抗包被的Dynabeads™磁珠（使用靶向其他外泌小体膜表面标志物的不同抗体），凭借磁性方法来分离外泌小体。

这些标志物要基于外泌小体的细胞来源进行选择。最常用于外泌小体分离和鉴定的膜表面标志物为CD9、CD63、CD81或TSG101。下表列举了一些最近用于鉴定或分离外泌小体的参考文献和膜表面标志物：

一般通过流式细胞仪（使用CD9、CD63、TSG101和Alix等膜表面标志物）来鉴定外泌小体，通过EM来研究其形态和尺寸，或凭借LC-MS/MS来实现更为详细的蛋白分析。

我们拥有多款外泌小体分离试剂盒，包括外泌小体—人源CD63（货号10606D），外泌小体—人源CD9（货号10614D），外泌小体—人源CD81（货号10616D）和外泌小体—人源EpCAM，适用于凭借这些常用的外泌小体膜表面抗原来实现外泌小体分离操作。如果您希望使用您的自备抗体通过其他特异性膜表面标志物来分离外泌小体，您也可使用我们的Dynabeads™外泌小体免疫沉淀（ProteinA，货号10610D），Dynabeads™外泌小体免疫沉淀（ProteinG，货号10612D）或用于分离/检测的外泌小体—链霉亲和素产品（货号10608D）。此外，用户也可选用抗小鼠IgG的Dynabeads™磁珠（货号11031或11033）和识别特定膜表面标志物的小鼠单抗来实现外泌小体分离操作。这些产品汇总于下表中：

这一换算需基于具体的磁珠尺寸，通常情况下，对于M-450磁珠而言，1 mg/mL磁珠大约相当于1.3 X 10E7个磁珠/mL；对于M-280磁珠来说，1 mg/mL磁珠大约相当于6.7 X 10E7个磁珠/mL。

甲苯磺酰基活化的M-450磁珠（货号14013）产品的化学结合性质、浓度和偶联方案均与停产的Dynabeads^™ M-500 Subcellular产品非常接近。

这需要基于您将使用的抗体宿主来进行选择。下表提供了Protein A或Protein G与不同类型抗体之间的结合强度：

Protein A和Protein G与不同种属和亚类的抗体/免疫球蛋白（Ig）之间的结合强度不同。

是的，基于不同的膜表面标志物所分离外泌小体中的蛋白表达谱之间会有明显差异。这一结论由Tauro等的研究证实，该研究团队基于EpCAM或A33这两种膜表面标志物，从人癌细胞系的条件培养基中分离出两群明显不同的外泌小体。蛋白组学研究结果显示这两群外泌小体是独特的。

可以。请参见此海报。

此外，这里还有一些相关引用：

• Blood 91:2573 (1998)
• Science 289:444 (2000)
• J Physiol 537:537 (2001)
• Mol Cell Proteomics 12:587 (2013)
• Biol Reprod 81:717 (2009) 

通常情况下，所有膜结构的细胞器均可通过Dynabeads^™磁珠进行分离。当与您自备的细胞器特异型抗体联用时，免疫—磁性分离法拥有数项优势：

• 该方法快速且柔和
• 无需任何费力的超速和密度梯度离心
• 可分离不同密度的细胞器组分
• 能够获得高纯度的细胞器

一些识别细胞器抗原位点的抗体有商品化的产品可供购买。您可在两种技术之间进行选择；

• 直接分离技术：使用您自备的抗体/配体，通过短时程的共同孵育来包被Dynabeads™ 磁珠。之后将包被后的磁珠与粗提组份混合在一起。使用磁力架就能够将与Dynabeads™ 磁珠相结合的靶细胞器分离出来，之后以同样简单和快速的方式对其进行洗涤。
  
  
• 间接分离技术：将抗体/配体与含有靶标的粗提组份混合并孵育一段时间，使其相互结合。之后向样本中加入Dynabeads™ 磁珠进行短时程孵育，使靶标-抗体/配体复合物与磁珠结合。使用磁力架进行分离和洗涤。如果靶向特异性的抗体/配体直接包被在表面活化的磁珠上，则不能使用间接法。

从分离速度和效率的角度来考虑，我们推荐您使用直接法。不过如遇到靶细胞器上的抗原无法识别的情况（如埋在囊泡内部），选用间接法可能是有利的。

鉴定一个合适的抗原并拥有一个能识别未变性天然状态抗原的高亲和抗体，是至关重要的。亚细胞组份中的抗原表位必须可自由结合特异性抗体。如果抗原表位“埋藏”在组份内部而并不暴露在表面，则可能无法分离出靶细胞器。

在使用前适当的细胞匀浆操作是非常重要的。匀浆操作对于像肝脏一类的样本来说更容易，而对于酵母等其他样本来说较难。如果在匀浆过程中细胞核破裂，DNA会被释放出来，则可导致细胞器聚团。未经纯化的细胞样本中的细胞器团块可能会严重干扰免疫分离操作。

抗体/配体包被的Dynabeads™ 磁珠可在2–8°C条件下保存数周之久，而不损失抗原结合能力。经历储存过程后，这些包被的Dynabeads™ 磁珠需在使用前在PBS/BSA溶液中洗涤一次（5分钟）。

可以。我们推荐用户使用Dynabeads™ M-270 Epoxy或Dynabeads™ M-450 Epoxy来开展此种应用，因为这些磁珠的反应化学可在低温条件（4°C）结合囊泡/细胞器。

我们不推荐使用甲苯磺酰基活化的Dynabeads™ M-280或甲苯磺酰基活化的Dynabeads™ M-450来开展此应用，因为这些磁珠需要更高的反应温度（37°C），而通常理想的实验条件是在低温保持囊泡/细胞器。

纯化后的囊泡/细胞器可通过囊泡/细胞器中表达的蛋白直接共价偶联至Dynabeads™ 磁珠上。我们推荐在1小时的孵育过程后加入封闭蛋白（如BSA）。

如果样本很粘，则最好使用大磁珠（4.5 µm），因为大磁珠具有更高的磁性，在高粘度样本中更易向磁力架移动。如果希望获得更高的结合能力，则推荐选择2.8 µm的磁珠。

这一参数随着细胞类型，细胞器类型和丰度，一抗和磁珠类型等参数的变化而发生很大变化，因此很难给出非常针对性的建议。您很可能需要对磁珠—细胞器比率进行滴定实验，以优化分离效果。每100–200 µg未纯化的细胞组份（裂解产物）稀释于300 µL缓冲液（例如含2mM EDTA和5%FCS或BSA的PBS）中，可使用约2 x 10E7个磁珠作为测试起点。如果您的抗体亲和力很高，您可能达到接近100%的靶向囊泡筛选效果。根据已发表的文献报道，单一磁珠能够结合10-20个（如过氧物酶体）至数百个细胞器，具体数值将视您所用抗体和微珠包被效率而定。

用于分离细胞器的Dynabeads™ 磁珠产品并未进行专门的设计用于分离后洗脱细胞器。分离蛋白时，我们推荐使用高盐或低pH值条件（在SDS缓冲液中煮沸的操作将导致蛋白变性）。如果您希望尝试洗脱细胞器，您需要考虑细胞器与配体/抗体之间的相互作用。如果这一相互作用很强，您需要使用比相互作用较弱时更苛刻的条件。高盐条件可能导致细胞器破裂（渗透应力）。您可尝试低pH条件，但我们无法确保结果，您需要尝试优化条件。我们拥有一款产品——Dynabeads CELLection™ 泛小鼠IgG（货号11531D）——其中抗体（抗小鼠IgG）与Dynabeads™ 磁珠之间由一段DNA接头相连，而这一接头可在分离操作结束后通过DNA酶来剪切，从而释放出带有抗体的细胞器。也可使用我们的FlowComp™ Flexi试剂盒（货号11061D）产品。

我们拥有几种表面活化的Dynabeads™ 磁珠，均能帮助您将自备抗体共价偶联至磁珠上。这些产品包括甲苯磺酰基活化的M-450磁珠（货号14013），甲苯磺酰基活化的M-280磁珠（货号14203和14204），M-450 Epoxy（环氧）磁珠（货号14011），M-270 Epoxy磁珠（货号14301），M-270 胺基磁珠（货号14308），M-270 羧基磁珠（货号14306D）。

如果您不考虑磁珠释放操作的话，您可选用：

二抗包被的Dynabeads™ 磁珠：

Dynabeads™ ProteinA/G 磁珠

Dynabeads™ 链霉亲和素磁珠

如果您希望在分离操作后温和地去除磁珠，您可选用：

FlowComp™ Flexi 磁珠

Dynabeads™ CELLection™ 生物素结合剂

Dynabeads™ CELLection™ 泛小鼠IgG

分离内涵体和溶酶体的相关引用：

• Mol Biol Cell 11:2775 (2000)
• J Biol Chem 275:7004 (2000)
• J Cell Sci 111:141 (1998)
• Proc Natl Acad Sci U S A 95:8613 (1998)

分离源自ER的转运囊泡的相关引用：

• Science 289:444 (2000)
• Science 295:848 (2002)
• Mol Biol Cell 9:623 (1998)
• J Cell Sci 110:2117 (1997)
• J Neurosci 21:7506 (2001)
• J Biol Chem 274:35577 (1999)

使用Dynabeads^™ 磁珠分离线粒体及其他细胞器的相关引用：

• Electrophoresis 19:1205 (1998)
• Biochem Biophys Res Commun 295:1027 (2002)
• J Neurosci 21:7506 (2001)
• J Biol Chem 276:32338 (2001)
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• J Cell Biol 138:291 (1997)
• J Biol Chem 275:7004 (2000)

使用Dynabeads^™ 磁珠分离线粒体和叶绿体以及线粒体/叶绿体核酸的相关引用：

• Genomics 60:67 (1999)
• Biotechniques 26:336 (1999)
• Int J Legal Med 108:237 (1996)
• Am J Hum Genet 60:408 (1997)
• Int J Legal Med 106:85 (1993)
• Biotechniques 16:484 (1994)
• Mol Ecol 4:731 (1995)

在天然条件下，T细胞的活化是由树突细胞等抗原呈递细胞（APC）上的主要组织相容性复合物肽和B7家族成员对T细胞上的T细胞受体（TCR）/CD3和CD28的募集作用来介导的。这两种刺激信号对于产生有效的免疫反应均是必需的。第一信号途径能够确保只有含特异性识别该肽的TCR的T细胞被激活。初始T细胞持续表达的唯一协同刺激受体为CD28，该第二信号途径使T细胞能够对一个抗原进行响应。在缺少CD28协同刺激的条件下，只有T细胞受体信号则导致T细胞无能。

包被了CD3/CD28抗体的Dynabeads™ 磁珠可作为人工APC（aAPC），来模拟T细胞的天然激活过程。

下图展示了T细胞天然激活（上图）和通过CD3/CD28抗体包被的Dynabeads™ 磁珠激活（下图）的机制：

Dynabeads™ CD3/CD28能够提供比传统方法（如丝裂原或可溶性/平板结合抗体）更高的扩增效率和更稳定的结果。这主要是因为：

• 优化的磁珠—抗体比率和稳定的磁珠包被效果
• 磁珠的大小与哺乳动物细胞很接近，因此能够为靶T细胞上的TCR/CD3和CD28提供三维的和同步的信号从而真实地模拟APC
• Dynabeads™ CD3/CD28提供简单易用的即用型形式，从生产日期开始有24个月的保质期 
• An expansion platform covering mouse and human research, translational research, and clinical applications
• 激活初始T细胞可诱导出更多中央记忆型表型 (Cytotherapy 16:619 (2014)).

所有T细胞激活或扩增试剂盒中磁珠的尺寸均为4.5μm。

我们推荐您使用人AB血清（从AB血型的供体提取的血清，不含抗A或抗B抗体）。也可使用常规的FBS，但T细胞克隆扩增研究中的大多数研究者已换成AB血清。

一些CD8+ T细胞并不表达CD28抗原。这意味着在操作CD8+ T细胞克隆时——与操作CD4+细胞克隆相反——必须确定CD8+细胞克隆是否表达CD28。对于CD8+细胞的多克隆性扩增操作，请按照产品手册中的描述，在激活和重复刺激过程中使用推荐的磁珠：细胞比率。不要在第8-12天之前进行重复刺激，刺激时间视具体应用而定（形成很多细胞:磁珠聚集物，细胞产生大量对生长十分重要的IL-2，因此在这一时间点不应更换培养基）。另一个推荐的选项是在重复刺激过程中向培养基中添加20-100U IL-2，但这一操作不是必需的。

对于抗原特异性/primed人源CD8+细胞而言，我们推荐您使用Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28/CD137产品，CD137有助于这些细胞生长和增殖地更好；或使用仅包被了CD3和CD28抗体的Dynabeads™ 磁珠。请参见以下参考文献。 

T细胞的激活过程在数分钟内即会发生。何时对细胞进行分析基于您的实验而定（如T细胞信号：数分钟内；体外扩增：8–12天）。

使用Dynabeads™ CD3/CD28磁珠刺激的CD4+ T辅助细胞将会分化为不同的T辅助细胞亚群，具体视体外培养条件下添加的细胞因子而定。

• Dynabeads™ + IL-2的组合能够诱导形成Th1亚群（也可添加IL-12）
• Dynabeads™ + IL-4 + IL-2的组合能够诱导形成Th2亚群
• Dynabeads™ + IL-1b + IL-6，IL-21和TGFβ将诱导形成Th17亚群

Dynabeads™ CD3/CD28专为初始T细胞的激活进行了优化，能够在近距离给予强烈的抗CD3信号和抗CD28抗体的协同刺激信号。刺激完成后，T细胞中的大部分会成为表达CD62L、CD45RO、CD28、CD27、CCR7和CD95的T stem central memory/T central memory cells （中央记忆型T细胞）。

其中只有一小部分为效应记忆型T细胞或终末分化（T_EMRA CD57+）细胞，而不同于由抗CD3抗体（OKT-3）扩增的T细胞。

这要具体视您使用的产品而定：

• CTS Dynabeads™ CD3/CD28（货号40203D）和Dynabeads™ Human T-Expander CD3/CD28（货号11141D）：在T细胞的扩增操作中（>3天）使用3:1的磁珠:T细胞比例。重复刺激时请使用1:1的磁珠:细胞比例。
• Dynabeads™ Human and Mouse T Cell Activation CD3/CD28（货号11131D、11132D、11161D、11456D、11452D、11453D）：短时程刺激，扩增和重复刺激时，请使用1:1的磁珠:细胞比例。
• Dynabeads™ Human Treg Expander（货号11129D）：进行细胞扩增时请使用4:1的磁珠:细胞比例。
• Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28/CD137（货号11162D，11163D）：用于T细胞克隆/细胞系的扩增和重复刺激时，请使用1:5-10的磁珠:细胞比例(1:10)。

不会，只有T细胞会响应刺激信号并在培养条件下生长。一周后CD3+细胞的纯度通常会超过95%。刺激MNC会产生某些问题，因为系统中存在的单核细胞可能会吞噬磁珠。我们建议您去除MNC中的单核细胞，或在T细胞活化/扩增之前通过冻存/复苏，塑料粘附或使用Dynabeads™ CD14（货号11149D，适于人源RUO）等标准方法对T细胞进行分离。

在培养3-4天后，大多数Dynabeads™ 磁珠会从细胞上脱落下来。

在扩增实验方案中，我们推荐您在第8-12天的时候（时间视具体实验而定），借助于磁力架来去除磁珠。彻底吹打磁珠:细胞复合物，之后放置于磁力架上2分钟，再将含有释放的细胞的上清液移至新的离心管中。弃去用过的磁珠，加入新鲜的磁珠进行二次刺激。

在短时程活化中，可直接对磁珠结合的细胞进行裂解，以用于后续分子水平的检测。第1-3天时，磁珠会与细胞形成强烈的聚集，因此在这一时期很难在不损失大量细胞的条件下去除磁珠。

可以，当T细胞与Dynabeads™ 磁珠孵育时，它们通常会在12小时内在孔中形成肉眼可见的细胞—磁珠聚集物。2-3天后细胞将进入大量扩增阶段（细胞分裂），这时它们的尺寸会发生显著增加，形态也会变得更加伸展。扩增之后（第8-12天），它们会恢复其通常的形态（圆形和清晰的边界）。下图展示了，用Dynabeads™ Human T-ActivatorCD3/CD28（货号11161D，11131D，11132D）扩增抗原特异性CD8+ T细胞2-4天后， T细胞的典型形态学改变。

不，不会结合。该产品是特异性的抗CD28抗体。

通常情况下我们推荐在第8-12天之间使用新磁珠进行重复刺激，基于您的应用而定。请按照产品手册中的说明进行重复刺激操作。

Dynabeads™ CD3/CD28/CD137专为抗原特异性/primedT细胞的活化进行了优化，能够近距离提供较弱的抗CD3信号和抗CD28与抗CD137抗体的协同刺激信号。在活化和扩增记忆型T细胞时，我们推荐使用1:10的磁珠:靶细胞比例。在primed/抗原特异性T细胞的扩增中，每个T细胞使用过多的磁珠可能会诱导凋亡。与之相反，Dynabeads™ CD3/CD28（无CD137）产品专为初始T细胞的活化进行了优化；与抗原特异性/primedT细胞相比，初始T细胞的活化需要更强的抗CD3活化信号。

注意：只适用于Dynabeads™ Human T-ActivatorCD3/CD28/CD137（货号11162D，11163D）

它们的主要区别在于：

• 用途：Dynabeads^™ Human CD3/CD28/CD137专为抗原特异性/primedT细胞的活化进行了优化，能够近距离提供较弱的抗CD3信号和抗CD28与抗CD137抗体的协同刺激信号。Dynabeads^™  Human T Activator CD3/CD28（无CD137）产品专为初始T细胞的活化进行了优化；与抗原特异性/primedT细胞相比，初始T细胞的活化需要更强的抗CD3活化信号。
• 不同的克隆来源：这两款产品中的CD3和CD28抗体源自不同的克隆：
• 不同的实验方案：相比初始T细胞的活化（1:1的磁珠:靶细胞比例）而言，活化抗原特异性/primedT细胞所需的磁珠很少（1:10的磁珠:靶细胞比例），所以请按照实验方案说明进行操作以获得最佳结果。基于此原因，Dynabeads^™  CD3/CD28/CD137产品中的磁珠浓度也更低。本品溶液清澈，而不像其他的Dynabeads^™ 磁珠那样为棕色，不过请注意里面是含有磁珠的！开展任何类型的实验时，请在取用所需体积的磁珠前，对试剂管进行适当的混匀。

Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28/CD137为抗原特异性/primedT细胞的活化和扩增提供了一个简单易行的方法，免去了对抗原呈递细胞或抗原的需求。用户不再需要鉴定和制备与供体匹配的MNC，这大大节省了时间，供体血样，和对Ficoll™ /Lymphoprep™ 溶液和抗原的使用。使用Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28/CD137产品激活抗原特异性/primedT细胞的机制概括于下图中。

Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28/CD137通过使用三种活化信号：CD3，CD28和CD137，相应抗体均结合于体积接近抗原呈递细胞的三维磁珠之上，模拟了体内通过抗原呈递细胞进行的T细胞活化。

我们推荐您使用1:10的磁珠:靶细胞比率。在所选培养基（如advancedRPMI-1640/CTS™ Op™ izer™ T细胞扩增SFM）中添加2%人AB血清和2mM 谷氨酰胺，以及50 U/mL rIL-2，来用于细胞的培养。对于CD8+ T细胞的扩增，我们推荐您加入5 ng/mL的rlL-7。下表中概括了种板密度，每孔所需的磁珠体积和培养基体积等信息。

是的，所有的T细胞激活后都会发生CTLA-4的表达上调现象。不过，在使用Dynabeads™ 磁珠激活T细胞的过程中，不存在CTLA-4（B7）的配体，所以T细胞的扩增不会受到抑制。与之相反，表达B7的APC会与CTLA-4相结合，从而产生抑制性信号。

Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28专为初始T细胞的活化进行了优化，而Dynabeads™ Human Treg Expander专为调节性T细胞进行了优化。这两款产品拥有相同的抗体克隆和相同的CD3:CD28比例。

我们提供三种不同体积的Dynabeads™ Mouse T-Activator CD3/CD28产品（货号11456D（0.4 mL），货号11452D（2 mL），货号11453D（5 x 2 mL））。这一产品主要适用于小鼠CD4+或CD8+ T细胞，或小鼠Treg细胞的活化。

我们推荐您在添加了2 mM 谷氨酰胺和10%FBS，以及30 U/mL小鼠rIL-2（也可使用人源的rIL-2）的advancedRPMI-1640中培养小鼠T细胞。最佳的磁珠:靶细胞比例为1:1。对于短时程活化小鼠T细胞的操作，我们推荐在96孔培养板中每孔100-200 μL培养基的条件下，以每孔8 x 10E4个小鼠T细胞开始尝试。对于扩增小鼠T细胞的应用，我们推荐您在适当的培养板/培养瓶中以1-1.5 x 10E6/mL T细胞开始尝试。磁珠:细胞比率及IL-2浓度与激活T细胞时相同。

我们推荐您在添加了2 mM 谷氨酰胺和10%FBS，以及2000 U/mL小鼠rIL-2（也可使用人源的rIL-2）的advancedRPMI-1640中培养小鼠T细胞。磁珠:靶细胞比例为2:1。对于扩增小鼠Treg细胞的应用，我们推荐您在适当的培养板/培养瓶中以1-1.5 x 10E6/mL T细胞开始尝试。

参考培养T细胞的经验，起始种板密度为~0.5–1 x 10E6个细胞/mL，并在浓度达到~1.5–2.5 x 10E6个细胞/mL时进行传代。

我们推荐您对这些培养板使用以下细胞数量和体积：

天然情况下，细胞表面的TCR-CD3复合物会持续内吞和重新插入胞膜。当Dynabeads™ 磁珠与培养细胞上的CD3/CD28相结合时，TCR-CD3复合物即会发生内吞并随之降解。当这一进程发生时，胞膜表面不再有磁珠结合的靶点，因此磁珠就被释放到培养基中。磁珠—细胞聚集物能够存在3-4天，直至磁珠从细胞上脱落。

T细胞受体（TCR-CD3）复合物由数个不同的亚基所组成，其中TCR的可变免疫球蛋白区（V）与配体间发生结合。CD3亚基和TCR的胞内尾部会与胞浆信号蛋白发生相互作用。复合物的胞内部分存在有几种内吞信号。

组成型内吞（无配体结合条件）：

我们从文献中得知，约有20种基于酪氨酸的内吞模体和2种双亮氨酸模体能够在无配体结合的条件下持续介导TCR-CD3复合物的胞膜内吞过程。再循环过程约为100分钟（从胞膜运送至早期内涵体，再返回胞膜），10次循环之后TCR-CD3复合物会靶向进入溶酶体中的降解途径。

诱导性内吞（存在配体结合条件）：

TCR-CD3复合物的配体依赖型内吞过程是由泛素介导的。一旦结合了配体，泛素即与复合物胞内尾部的某一氨基酸发生偶联，从而导致复合物的网格蛋白依赖型内吞及随后的溶酶体降解过程（内吞在2小时左右到达平台期 (Nature 375:148 (1995)) 

当磁珠与CD3-CD28结合时，复合物将发生主动的内吞和降解过程。当这一进程发生时，胞膜表面不再有磁珠结合的靶点，因此磁珠就被释放到培养基中。如果不将磁珠从培养基中移除，它们则会在TCR-CD3复合物重新出现在胞膜表面时再次与其结合。