Dynabeads细胞分离与扩增支持 –问题排查

这里列举了一些建议：

• 良好的回收和纯度基于高质量的MNC制备，其中颗粒细胞和血小板的数量要低。
• 在混匀步骤使用HulaMixer™样品混合器（目录编号15920D）以确保有足够的抗体与靶细胞相结合。
• 在抗体结合步骤之后对细胞进行良好的洗涤，以去除未结合的抗体。
• 2X rosetting方案能够提升细胞纯度，而不增加分离过程中使用的Dynabeads™磁珠数量。

这里列举了一些建议：

• 样本制备：所有的分离操作都必须在单细胞悬液中进行。
• 请确保使用了正确的细胞数量，稀释倍数和抗体混合物体积，Dynabeads™磁珠和缓冲液系统。
• 在混匀步骤使用HulaMixer™样品混合器（目录编号15920D）以确保分离操作中的混合效果良好。
• 在接触磁力架前的最后操作步骤中，用户须使用1 mL枪头吹打10次以上来将细胞/磁珠充分重悬。这一操作能够帮助用户捕获滞留的目的细胞。
• 配制分离和洗涤缓冲液的PBS应不含Ca²⁺和Mg²⁺，以避免细胞发生补体活化或聚集。

血小板激活经常在单核细胞的分离过程中造成麻烦，因为激活后的血小板会结合单核细胞并产生单核细胞与血小板聚集的不利情况。有几类因子能够引发血小板的激活效应，如温度改变，机械因素（即剪切力），暴露于抗凝剂肝素（通常存在于样品管中）下，等等。为了避免血小板的活化（及后续的单核细胞聚集），这里提供一些应遵循的常规建议：

• 换用肝素之外的其它抗凝剂（如ACD，EDTA或柠檬酸钠）。
• 血样应保存于室温直至制备MNC，MNC制备过程本身也应该于室温下进行。
• 应轻柔地处理样品，以最大程度地减少机械剪切力。如果可能，请使用注射器/针头手动滴入血样，而不要使用Vacutainer™管，因为此类样品管中的真空条件通常会导致血小板与单核细胞的共同活化。
• 柠檬酸钠已知能够“稳定”血小板并避免其活化，同时包含——除作为抗凝剂的柠檬酸缓冲液之外——茶碱，腺苷和双嘧达莫。
• 请确保按照我们的实验方案来制备MNC，这些步骤专为获得低血小板含量的MNC而设计。

是的，DETACHaBEAD™的外观浑浊是正常的，由于其中的蛋白含量非常高，进而可能出现蛋白沉淀现象。这并非细菌污染，不会影响分离与释放细胞的回收率和活力。在使用前彻底混匀溶液。

这里列举了一些建议：

• 在使用前将DETACHaBEAD™溶液彻底混匀。
• 获得良好得率最为关键的参数是在孵育过程中DETACHaBEAD™溶液与样品的混匀效果。我们推荐用户采用能够持续维持管体运动状态、并让样品保持在管底以避免磁珠变干的混合器或旋转仪（如HulaMixer™样品混合器（目录编号15920D））。
• 减少细胞分离过程中的孵育时间（较低的亲和力会提升释放效率）。
• 在与DETACHaBEAD™产品孵育后、放到磁力架吸附操作前，对磁珠结合的细胞上下吹打至少10次，以尽可能多的使磁珠从细胞上脱落。过于剧烈的吹打会降低细胞的活力。
• 在操作过程中避免不必要的延迟。

这里列举了一些建议：

• 由于DSB-X 生物素-链霉亲和素之间的结合随着时间延长而逐渐变强；因此不要将释放步骤的时间延长至实验方案中规定的时间以上。在某些案例中，更短的孵育时间会获得更高的得率。
• 在与解离试剂孵育后，我们推荐您在将样本放置到磁力架上之前，使用1 mL枪头吹打样品10次以上，以充分重悬样本。

最佳的选择是将Dynabeads™ FlowComp™ Flexi试剂盒与一款用于细胞分离的合适靶标抗体联用。Flexi试剂盒含有进行分离和释放操作所需的部分试剂，包括用于对您的抗体进行生物素化操作的DSB-X生物素化试剂盒，经修饰的链霉亲和素包被的FLowComp™ Dynabeads™ 磁珠和FlowComp™ 释放缓冲液。

这里列举了一些建议：

• 请确保RPMI+1% FBS的pH值不要太高：DNA酶I在pH 7.0–7.4之间的效率最高（RPMI暴露于大气环境中会导致pH值增加，pH指示剂会变紫）。
• 请勿在DNA酶I的处理过程中使用RPMI+10% FCS。应用10%的FBS会比1%的FBS获得的细胞得率更低（可能由于一些批次的FBS中含有的DNA酶I抑制因子）。
• 请确保缓冲液中含有DNA酶活性所需的Mg2+/Ca2+。
• DNA酶I必须温和处理。剧烈搅拌DNA酶溶液会降低酶活性。一定不要对DNA酶溶液进行涡旋操作。
• 当回收较低数量的细胞时，我们推荐您使用RPMI+1% FBS培养基预先包被管体，以减少细胞的损失（细胞很粘，容易在分选过程中贴附于管壁上）。
• DNA酶I在20°C条件下具有良好活性，不过，我们推荐用户在DNA酶I的处理步骤之前将RPMI+1% FBS预热至37°C，因为不同实验室的室温并不相同。
• 当细胞与DNA酶释放缓冲液孵育后，在使用磁力架分离之前对磁珠-细胞混合物进行彻底的吹打非常重要，这样可提供机械力打断DNA连接。未仔细吹打细胞将会降低细胞的得率。

这里列举了一些建议：

• 在CELLection™ Dynabeads™ 磁珠的包被过程中，对靶标抗体的数量进行滴定/优化。
• 如果目的细胞的数量很低，或细胞表面的靶标抗原浓度很低，则推荐使用间接法技术。
• 使用>1 x 10E7个磁珠/mL样品（>25 μL）。
• 在使用前对全血样本进行洗涤。
• 为了确保获得最高效率的细胞释放效果，绝对不要在溶解冻干DNA酶的过程中涡旋DNA酶溶液。
• 在释放细胞的过程中，请将新鲜配制的RPMI/1% FCS预热至37°C。
• 确保缓冲液的pH值在7.0-7.4之间以获得理想的DNA酶I活性。更高的pH值会抑制DNA酶的活性。
• RPMI中应含有足量的Mg2+以帮助DNA酶发挥活性。
• 当细胞与DNA酶释放缓冲液孵育后，在使用磁力架分离之前对磁珠-细胞混合物进行彻底的吹打非常重要，这样可提供机械力打断DNA连接。未仔细吹打细胞将会降低细胞的得率。

这里为用户提供一些保持细胞最优生长条件的提示：

• 保持0.5– 1.5 x 10E6个细胞/mL的细胞最佳生长密度非常重要。当细胞密度超过1.5-2.5 x 10E6个细胞/mL时，就需要重新进行刺激。
• 请按照产品手册中提供的磁珠:细胞比例，每8-12天重新刺激一次。
• 请按照手册中所提供每一产品特定的正确磁珠:细胞比例进行活化操作。使用过量磁珠会抑制细胞活化/扩增。
• 使用优化的细胞培养基，加入：
  • 生长因子（IL-2，IL-7，IL-15，或其他细胞因子）
  • 促生长添加剂（如人血清/FBS，L-谷氨酰胺/Glutamax，自由基清除剂（10 mM N-乙酰半胱氨酸））