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我们总结了一系列要点提示和技巧并建立了一个详细的知识库,以满足您的各类科研需要求,助您优化试验,获得最理想的结果。

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概述

Gibco™ Geltrex™基质与胶原(大鼠尾与牛)可作为包被溶液或3D凝胶基质来使用。CELLstart™底物作为一种不含外源性物质的包被基质,专为ESC的相关应用而研发(作为动物源性的Gibco™ Geltrex™基质或Matrigel™基质的一种底物)。AlgiMatrix™ 基质为一种3D支架类的基质,它并不为细胞提供粘附的基础,而是为细胞球提供一个良好的生长环境,后续应用中也可方便细胞球的收取操作。

Gibco™ Geltrex™ 基质

Gibco™ Geltrex™基质是减生长因子(reduced growth factor,RGF)基底膜抽提物(BME)的可溶性配方产品,是从鼠类Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤中纯化获得的。在历史上这些制备产物中含有并不会影响产品效价的乳酸脱氢酶增高病毒(LDEV),但在某些如异种移植及其他临床性研究一类的应用中可能会引发顾虑。当前我们已通过全新的生产方法去除了这些病毒。我们使用PCR方法确认了这些产品中不含病毒。 

Gibco™ Geltrex™基质是含有细胞粘附所需的胶原IV,层粘连蛋白及其他基质蛋白和生长因子的基底膜抽提物。AlgiMatrix™基质只含不具有细胞粘附促进功能的藻酸盐。藻酸盐海绵体中没有能与细胞相互作用的成份。

是的,尝试使用不同稀释浓度的基质来包被平板。一些客户使用1:100的稀释浓度获得了更好的结果。最佳稀释浓度取决于所使用的细胞系。

如果您希望从基质中取出细胞进行培养,我们推荐您首先润洗细胞,之后使用胰酶/EDTA,TrypLE™试剂,或使用低葡糖DMEM配制的3000U/mL胶原酶和1000U透明质酸酶溶液解离细胞。如果您希望对基质中取出的细胞进行细胞膜表面标志物的染色,我们推荐您以机械方法取出细胞,如剧烈润洗或仔细刮下。

请注意,如果细胞从基质中取出后培养于2D条件下,那么细胞的表型可能发生改变。

乳酸脱氢酶增高病毒(LDEV)会感染小鼠巨噬细胞,并导致实验室小鼠群体的持续性感染。LDEV是一类RNA病毒,会改变小鼠的体内生理活动,是源自可移植肿瘤细胞系的生物试材的常见污染物。

是的,这是正常情况。我们在产品开发过程中也见到了类似情形。请在预包被处理后吸去Gibco™ Geltrex™基质溶液,再按常规操作加入细胞。我们使用即用型成品Geltrex™基质预先包被的平板来培养H9人体胚胎干细胞,在进行预包被步骤时有过类似发现。 

即用型成品Gibco™ Geltrex™基质仅适用于为细胞粘附提供包被,主要为ESC和iPSC的应用进行研发。由于蛋白浓度不够高,它不适于厚凝胶或3D培养的相关应用。

AlgiMatrix™ 3D Culture System

AlgiMatrix™基质在不开封的条件下可稳定放置12个月。一旦开启,整板都需及时用掉。

我们展示了以下数据:

  1. 聚焦在培养细胞时,可显示细胞已接种的证据。
  2. 石蜡包埋和切片结果显示细胞接种到了整个海绵体。

轻柔地以一定角度加入培养基。补加细胞时请小心操作,不要搅动基质。

一旦接种完成,细胞球将在5至7天内形成。接种过程中会观察到气泡。随着细胞对氧气的逐步消耗,这些气泡将在数天内消失。

Invitrogen™ alamarBlue™试剂检测是一项通过检测还原能力来监控细胞健康和功能情况的有用生物分析法。

可以,您可使用钙结合液,Versene(乙二胺四乙酸)或柠檬酸钠来溶解基质。剩余的细胞球可通过TrypLE™试剂解离下来,并在其他培养瓶,或新型AlgiMatrix™基质海绵体中进行扩增。随试剂盒附赠的说明手册中对这些操作步骤进行了图解说明。 

我们内部未对此应用进行测试,通常情况下人们相信如果藻酸盐支架能够在无饲养细胞的条件下支持人体ES细胞的增殖,则应该也能支持小鼠ES细胞的增殖。小鼠与人体细胞均会形成类胚体,从增殖和分化的角度而言,使用带有较大孔隙的藻酸盐支架对于培养这些结构非常有帮助。

使用藻酸盐实际上不会造成任何背景着色。能避免细胞粘附的同一表面性质也使荧光素标记抗体等分子很难粘附,因此实际上未发现任何背景染色效果。

这种支架结构非常适合形成三维球体,允许最大限度的细胞间相互作用。根据细胞类型的不同,已建立的细胞系可以通过增加细胞球的大小而扩大到100个细胞左右。以三维形式培养1-2周后,原代细胞和已建立细胞系都将进行分化。

对于脐带干细胞而言,您可能希望尝试相对较高的接种密度——每个海绵体10万-30万个细胞,并每天或每两天当培养基变“黄”时进行培养基补加。

标准的免疫荧光检测能用于3D结构。您可对AlgiMatrix™基质中自然生长的细胞球进行直接染色,也可使用Versene或55 mM 柠檬酸三钠二水合物溶液来溶解掉AlgiMatrix™基质,再单独对细胞球进行染色。您也可使用TrypLE™试剂将细胞球进一步解离为单个细胞,再对分散细胞进行染色。 

侵润研究是对细胞穿透基质能力进行检测的研究,这一检测模拟了细胞在体内转移的活性。AlgiMatrix™基质未经修饰的结构中仅含有藻酸盐(源自海带),而不含任何体内物质,所以AlgiMatrix™基质与细胞侵润之间的相关性不是很强。

我们的供应商多年来一直生产药用级海藻酸和透明质酸。虽然这些都是天然的产品,但通过指定获取地点(以海藻酸盐为例)、水温、海藻中要获取哪些部分等其它方面,使用严格的净化操作规程和严格的QC标准,就可以得到非常标准的产品。

最近推出的高纯度藻酸盐产品不会引起之前低纯度产品所面临的敏感性反应。藻酸盐多年来一直在体内移植(糖尿病相关研究)领域用于包裹胰腺B细胞一类的物质,而不会引起排异反应。 

用于制备AlgiMatrix™基质的藻酸盐,具有非常亲水的表面,含脂质的细胞膜甚至分子都不会粘附其上。正常细胞在AlgiMatrix™基质会聚集形成细胞球并分化成结构,但扩增会受到限制,因为大多数正常细胞数目的增加需要以粘附为前提。癌细胞能够在不粘附的情况下保持增殖,在AlgiMatrix™基质中也是如此(一个例外是胚胎干细胞,这一类型的细胞在AlgiMatrix™基质中会增殖为类胚体)。不过,软琼脂与AlgiMatrix™基质之间的一个主要区别在于:软琼脂是一种水凝胶,而AlgiMatrix™基质则是拥有较大孔径尺寸的海绵体——细胞在AlgiMatrixTM基质中能够比在水凝胶(软琼脂)包裹下更容易和更迅速地进行生长。从正常细胞中区分癌细胞的经典方法是观察细胞的增殖;癌细胞(如HepG2肝癌细胞)会形成不断扩增的细胞球,而正常细胞所形成细胞球的尺寸和数量都不会增加。

海绵体在干燥时的高度为3-4mm左右。当海绵体重新水化时,其体积本质上是不变的——不会发生膨胀或体积增加的情况,实际上还会由于恢复了水凝胶状态而体积轻微缩小,这一情况在对已接种细胞的海绵体进行短暂离心时尤其明显(试图让细胞更多进入海绵体内部,并让海绵体均匀地分布于培养孔底部)。 

某些原代细胞(干细胞除外)需要贴壁才能增殖。由于细胞不会粘附于AlgiMatrix™基质,因此尽管这些细胞能够继续培养,但不会增殖而更倾向于分化。我们推荐您以高细胞密度种植原代细胞。

固化缓冲液通过向体系中加入钙成份来发挥作用——加入后海绵体会变硬。解离缓冲液通过去除体系中的钙成份来发挥作用——加入后海绵体会变软。

固化缓冲液通过向海绵体系中加入钙成份来发挥作用——加入后使海绵体会变硬。解离缓冲液通过去除海绵体系中的钙成份来发挥作用——加入后使海绵体会变软。

除了Invitrogen™ alamarBlue™细胞活力试剂(Cell Viability Reagent)之外,AlgiMatrix™基质还能够与Invitrogen™ PrestoBlue™细胞活力试剂,Promega™ Cell Titer-Glo™试剂或InvitrogenTMCyQuant™ Direct细胞分化测定(Cell Proliferation Assay)试剂盒相兼容。具体实验方案与2D细胞培养系统相同,但需要加入纯AlgiMatrix™基质作为空白对照组。

I型胶原

其关键应用列举如下:

  • I型胶原能够在体外诱导出微血管内皮细胞的纺锤状外形,并排列为类似实线的聚集体。在I型胶原中进行培养时,血管内皮细胞也能够形成类似血管的管状结构。因此,I型胶原也可用于体外的血管生成实验。
  • 乳腺癌干细胞在I型胶原中培养时可发生分化。
  • I型胶原同样适用于原代结肠癌细胞系的培养;小鼠肝脏前体细胞和大鼠的胰岛细胞也可培养于3D的I型胶原中。
  • I型胶原可在细胞侵润分析中作为屏障,也可适用于细胞粘附的相关研究。

以下细胞类型通常培养于I型胶原中:

  • 内皮细胞(包括HUVEC)
  • 成纤维细胞
  • 肝细胞
  • 软骨细胞
  • 破骨细胞
  • 成骨细胞
  • 角质形成细胞
  • 角膜上皮

可用的酶包括:Gibco™ TrypLE™ Express酶,Gibco™ TrypLE™ Select酶或Gibco™ StemPro™ Accutase™细胞解离试剂(Cell Dissociation Reagent)。

I型胶原是以20 mM 乙酸溶液的液体形式来提供的。如果在准备过程中遇到困难,可先按1:2的比例将胶原稀释于20 mM,pH 3.5的乙酸中,之后再依照实验方案中的说明进一步稀释。

重组人Lamin-521 (rhLaminin-521)

是的。为确保单细胞传代后PSCs的最佳恢复,在传代前一天给PSCs添加Essential 8 Flex培养基。

rhLamin-521的最佳工作浓度与细胞系有关,必须通过经验确定。然而,对于某些细胞系,铺板浓度可低至0.3 μg/cm2而不降低性能。此外,4°C过夜放置可以支持低至0.1 μg/cm2的铺板浓度。

我们推荐在准备使用前把它放冰上。

是的,您可以使用EDTA或versene。然而,我们不推荐使用dispase或胶原酶,因为它会导致分化。