重组蛋白支持 - 入门

冻干蛋白通常可在2–8°C条件下储存数周，或在–20°C条件下长期保存。

蛋白溶液在低浓度的冰冻条件下冻存时通常不是很稳定。在冻融过程中，溶液中的某些蛋白会粘附在容器壁上，如果蛋白的起始浓度较低，则上述原因可能会导致造成蛋白浓度的进一步显著下降。因此，载体蛋白就是用于减少此类损失的。最为常用的载体蛋白包括牛血清白蛋白（BSA），人血清白蛋白（HSA）或胎牛血清（FBS）。这些载体蛋白通常的使用浓度是在0.1%。依根据经验数据，如果重组蛋白的浓度低于0.5 mg/mL，则推荐加入一些载体蛋白。

数据表中提供了重新溶解冻干蛋白的说明。我们推荐首先对盛装冻干蛋白的容器进行离心，以将这些粉末聚集在到管底。大多数蛋白可通过加入无菌蒸馏水来重新溶解。对于100 μg蛋白，所需加水量应在100 µL至1 mL之间，从而形成1 mg/mL至与0.1 mg/mL的蛋白溶液。如果需要除水以外的其他稀释剂，产品分析表中会对其进行说明。

溶解后的蛋白可按照工作用量进行分装。工作用量一般在10或20 μL左右。分装后的溶液应储存于聚丙烯管中。聚丙烯非常适合此种应用，因为蛋白不会强烈粘附于这种材质上。蛋白会粘附玻璃或聚苯乙烯材质，因此我们建议不要使用这些材质的储存容器来储存蛋白溶液。分装后的溶液可保存于–20°C条件下。如果您有–80°C冰箱可供使用，则这一温度条件更适于储存。

反复冻融会对重组蛋白的稳定性造成影响。举例来说，冰冻会显著影响蛋白溶液的pH值，可能会导致蛋白变性（（Arch Biochem Biophys 384:398 (2000)）。

Thermo Fisher Scientific™ 所提供的重组蛋白产品通常在大肠杆菌，昆虫细胞或哺乳动物细胞等不同的表达系统中产生。不同表达系统之间产生的重组蛋白的主要差别在于这些蛋白所携带的翻译后修饰，如糖基化修饰。在大肠杆菌中生成的重组蛋白未经糖基化。在昆虫细胞中产生的重组蛋白通常经有部分糖基化，但不含半乳糖和唾液脱盐酸，糖链也无复杂分支。在哺乳动物细胞中生成的重组蛋白会发生附带完全的糖基化修饰。

备注：Mimic™ Sf9 昆虫细胞（来源于sf9昆虫细胞系，经改造可稳定表达多种哺乳动物糖基转移酶）可产生用于表达带末端唾液酸和半乳糖的复杂的N-糖链。

在大多数情况下，生长因子或细胞因子的糖基化作用不会直接影响该蛋白与受体之间的结合。所以在体外研究中，重组生长因子或细胞因子的生物活性不会受糖基化作用的显著影响。不过，糖基化蛋白通常对蛋白酶的降解更不敏感具耐受性，所以在体内的半衰期比未经无糖基化的同种蛋白更长。因此在体内研究中，以选择哺乳动物表达系统或昆虫表达系统生产的重组蛋白可能是比大肠杆菌中生产的同种重组蛋白效果更好的一个选择要好。

生物分析法常被用来检测某一特定生长因子或细胞因子的生物学活性。在大多数情况下，研究人员一般基于各类指示性细胞——如某些原代细胞或细胞系——来开展生物分析。最为常用的生物分析法包括细胞增殖分析，细胞趋化性分析，细胞因子生成分析和细胞毒性分析。通常以ED50来表示某一细胞因子的生物活性，该值代表了能够诱发50%最大效应的细胞因子浓度。这一表示效价的方法仅适用于那些剂量效应曲线为S形的细胞因子。

ED50被定义为处于最大反应50%水平的细胞因子浓度。这一表示现效价的方法仅适用于那些剂量效应曲线为S形的细胞因子。将ng/mL单位的ED50活性值（注意：如当前为pg/mL，请先换算为ng/mL）转换为（注意：如需当前单位为pg/mL，请先换算为ng/mL）单位/毫克（unit/mg）特定活性值的公式为（当ED50表示为处于一个范围区间时，选择此范围的中点值）：

1 x 10E6/ED50* (ng/mL) = 以单位/毫克（Units/mg蛋白）表示为单位的特定蛋白特定活性

不是没有，Thermo Fisher Scientific™ 所提供重组生长因子和细胞因子的生物活性没有使用未经WHO标准的进行校准。因此，基于从ED50换算的活性（单位/毫克蛋白）只适用于QC检测中所使用的指示细胞（用于每一重组生长因子或细胞因子的指示细胞信息可于产品插页中找到）。因此，来自不同供应商的某一特定重组蛋白产品的生物活性只能在使用相同指示细胞时之间相互进行比较。

胚胎干（ES）细胞是源自早期哺乳动物胚胎的细胞，能够在体外进行无限的未分化增殖，同时保留分化为各类成体组织（包括生殖细胞）的潜能。ES细胞的多能性通常在体外通过以下方法来证明：将ES细胞诱导分化为类拟胚体，并以谱系特异性的标志物检测三个体胚层（内胚层，中胚层和外胚层）中分化细胞的谱系特异性标志物分化情况，或将这些细胞注射到免疫缺陷型小鼠中，以检测畸胎瘤中产生的细胞类型。

人胚胎干细胞源自人类囊胚内细胞团, 是通过使用兔抗血清检测BeWO细胞（人滋养层细胞系）抗血清的通过免疫外科法手段来进行分离的（Science 282:1145 (1998)）。

人体胚胎干细胞通常培养于经辐照消毒的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）之上，并加入使用含20% FBS（或20% Gibco^TM KnockOut^TM血清替代物），0.1 mM β-巯基乙醇，1% 非必需氨基酸）的高葡糖DMEM中（Science 282:1145 (1998); Dev Biol 227:271 (2000)）。

人胚胎干细胞也能够在无饲滋养层细胞的条件下培养于Matrigel^TM基质包被的培养容器和MEF条件培养基中（Nat Med 10:55 (2004)）。一旦在MEF或含MEF的条件培养基中建立了ES细胞，这些细胞就可在无饲滋养层的条件下，使用Gibco^TM Geltrex^TM基质包被的培养容器和添加了bFGF与 β-巯基乙醇的Gibco^TM StemPro^TM SFM培养基的组合进行培养，或使用Gibco^TM Essential 8^TM培养基和玻连蛋白包被的容器的组合中进行培养。

人体ES细胞一般可通过以下方法进行鉴定：经典型的形态（它们以致密的细胞团形式生长 生长为紧密聚集的小型细胞团，细胞小并具有高核质比）；表面标志物的表达；干细胞特异性基因表达的RT-PCR检测（如Oct3/4，Sox2和Nanog）；碱性磷酸酶染色和端粒酶活性检测。最为常用的人ES细胞特异性表面标志物包括发育阶段特异性的胚胎抗原SSEA-3和SSEA-4。其它的ES细胞特异性的其它表面抗原还包括TRA-1-60和TRA-1-81。（Science 282:1145 (1998)）。

用于细胞培养：人重组激活化素A（货号PHC9564），bFGF（货号PHG0261），IGF-II（货号PHG0084）（Stem Cells 24:1476 (2006); Nature 448:1015 (2007)）。

用于人ES细胞分化：BMP-4（货号PHC9533），EGF（货号PHG0311）和HGF（货号PHG0324）（Proc Natl Acad Sci U S A 97:11307 (2000)）。

bFGF的初级转录翻译产物由155个氨基酸组成，其中不含经典的信号肽（EMBO J 5:2523 (1986)）。分泌型人bFGF的成熟形式长度为146个氨基酸（N端的9个氨基酸残基可能被蛋白酶从155-aa个氨基酸的前体上切除）（（FEBS Lett 185:177 (1985)）。经相同条件下的测试，我们155 个氨基酸aa形式蛋白的生物活性（货号PHG0264）和146 个氨基酸aa形式（货号PHG0024）的生物活性非常相似，这说明bFGF的N氮端区域既不参与生物活性和，也不贡献与FGF细胞表面受体的结合作用。尽管这两种形式蛋白产物的生物功能间并无差别，我们还是推荐在ES细胞应用中使用155 个氨基酸aa的形式，而在神经细胞研究中使用146个氨基酸 aa的蛋白形式。这一推荐纯粹基于我们在产品研发阶段对两种形式产物的内部使用方法（即在ES细胞研究应用中使用155 个氨基酸aa的形式，而在神经科学研究中使用146 个氨基酸aa的蛋白形式），期间并未观察到发现产品性能上存在差异。

诱导性多能干细胞（iPS或iPSC）为一类多能干细胞，它们是通过在成体细胞中直接导入诱导编码“重编程因子”编码的基因组合的表达来获得而直接产生的。这些重编程因子包括Oct4，Sox2，c-Myc，KLF4，NANOG和LIN28。Yu等使用携带Oct4，Sox2，NANOG和LIN28基因的慢病毒诱导人间充质细胞系，进而获得了iPS细胞（Science 318:1917 (2007)）。使用基于类似方法，Takahashi等通过向在人原代成纤维细胞中诱导外源表达引入编码Oct3，Sox2，KLF4和c-Myc的基因的表达，获得了iPSC（Cell 131:861 (2007)）。通过重编程获得的iPS在形态，无限制增殖能力，表面抗原表达，基因表达，体外分化为三胚层的能力，以及诸如注射入SCID小鼠后形成畸胎瘤的能力等诸多方面与人ES细胞类相似。

人iPS与人ES细胞的生长条件相同。与人ES细胞类似，人iPS细胞能够生长于辐照的MEF滋养层细胞上+含20% KnockOut^TM SR，0.1 mM NEAA，1mM谷氨酰胺，0.1mM b-ME的DMEM/F12培养基 + 辐照MEF饲养细胞 + 100 ng/mL bFGF的培养条件中，或Matrigel^TM基质包被培养皿 + MEF条件培养基 + 100 ng/mL bFGF的培养条件中（Science 318:1917 (2007)）。人ES细胞与iPS细胞两者均可生长于KnockOut^TM ESC/iPS培养基中（货号A14131）。

ES细胞研究中使用的生长因子也同样可用于iPS研究：

用于细胞培养：人重组激活化素A（货号PHC9564），bFGF（货号PHG0261），IGF-II（货号PHG0084）（Stem Cells 24:1476 (2006); Nature 448:1015 (2007)）。

用于人ES细胞分化：BMP-4（货号PHC9533），EGF（货号PHG0311）和HGF（货号PHG0324）（Proc Natl Acad Sci U S A 97:11307 (2000)）。

间充质干细胞（MSC）是最初从骨髓或脂肪组织中分离出来的多专能细胞，它们表现出进一步分化为骨，软骨和脂肪细胞的能力。在常规细胞培养条件下，从骨髓中分离出的MSC为纺锤形，并拥有贴附于未包被塑料培养皿上的独特能力（Arthritis Res Ther 9:204 (2007)）。

可通过流式细胞术来鉴定人体MSC，这些细胞通常具有CD73+，CD90+，CD105+，CD11b-和CD45-的标志物属性（Blood 109:4245 (2007)）。人MSC表达Oct4，Sox2和Rex-1；这些mRNA均可通过RT-PCR技术进行鉴定（Arthritis Res Ther 9:204 (2007)）。

MSC可培养在含或不含血清的培养基条件下。标准的培养条件为含10% FBS的低葡糖DMEM。MSC也可培养于低减血清（2%）的Gibco^™  MesenPRO RS^™ 培养基（货号12746-012），或无血清的Gibco^™  StemPro^™  MSC SFM XenoFree培养基（货号A10675）和Gibco^™  StemPro^™  MSC SFM（货号A10332）中。通常情况下，MSC在含氧量较低的条件下（2% O₂）生长得较好（2% O₂）。

请参考我们下方的诱导MSC诱导分化的建议步骤：

对于培养在StemPro^™  MSC培养基中的MSC的分化的培养条件：需使用StemPro^TM MSC培养基。将成脂肪形成的分化：饲育将细胞以1.24 x 10E5个细胞/cm²的密度接种植于低糖的DMEM中，并在其中加入已添加10% MSC qualified FBS（货号12662011），2 mM glutamax，5 µg/mL庆大霉素和58 µg/mL人重组胰岛素，1 µM地塞米松, 0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤, and 和200 µM吲哚美辛的低糖DMEM中。. 

成骨分化：将细胞以3.08 x 10E4个细胞/cm²的密度接种植于低糖DMEM中，并向其中加入已添加MSC qualified FBS，2 mM glutamax，5 µg/mL庆大霉素，10 mM 甘油-2-磷酸，50 µM L-抗坏血酸，10 ng/mL BMP-2，和100 nM地塞米松的低糖DMEM中。

成软骨分化：以10 µL的液滴加入细胞接种细胞（每滴8 x 10E4个细胞）；细胞贴壁两小时后，将细胞培养于含用已添加10% MSC qualified FBS，的低糖DMEM中，并向其中加入2 mM glutamax，5 µg/mL庆大霉素，6.25 µg/mL重组人胰岛素，10 ng/mL重组人TGF-β1，和50 nM L-抗坏血酸的低糖DMEM培养细胞（Blood 112:295 (2008)）。

另外，我们还提供以下这些分化试剂盒：StemPro^™  成脂肪形成分化试剂盒（货号A10070-01），StemPro^™  成骨分化试剂盒（货号A10072-01），StemPro^™  成软骨形成分化试剂盒（货号 10071-01）。

用于MSC培养和自我更新的生长因子：LIF（PHC9484），bFGF（PHG0261），EGF（PHG0311），HGF（PHG0324），PDGF（PHG0043）和Wnt3。

用于MSC分化的生长因子或细胞因子：BMP-2（PHC7145）与TGF-β1（PHG9211）。

(Arthritis Res Ther 9:204 (2007)).

浏览我们的Gibco™ MSC研究产品。

神经干细胞（NSC）是神经系统中能够自我更新的多专能细胞，拥有分化为神经元，少突胶质细胞和星形胶质细胞的潜能。神经干细胞可由胚胎干细胞诱导分化而来，或从皮层，脑室下区（SVZ）和脑室区等多个不同脑区分离获得，或从骨髓来源的间充质干细胞（MSC）生成 (J Cell Biochem 114:764 (2013))。NSC是研究神经发生和神经递质与受体功能的宝贵工具。来自在各类动物疾病模型中的NSC被广泛应用于包括例如帕金森氏病与亨廷顿氏病舞蹈症在内的等多种不同类型的CNS疾病的研究中（J Cell Biochem 114:764 (2013)）。

当按照克隆密度进行培养时，通常可基于用神经球的形成能力来鉴定NSC（Nat Methods 2:333 (2005)）。也可通过（1）Sox1，Sox2和Nestin的RT-PCR检测或（2）nestin，Pax6，Sox2和Ki67的免疫组化染色来鉴定NSC。

人NSC可培养于Gibco^™  StemPro^™  NSC SFM（货号A1050901）和Gibco^™  Geltrex^™ 基质/或Gibco^™  CELLstart^™ 底物基质预先包被的培养皿中。另外，如果用户的研究目的是获得神经元，也可在已添加了Gibco^™  B-27^™ 添加剂（不含维生素A）的Neurobasal^™ 培养基（不含维生素A） + 预先包被的培养皿中培养NSC。

以下生长因子可用于NSC的扩增：重组EGF（货号PHG0314），重组bFGF（货号PHG0024)，和重组VEGF（货号PHC9394）。此外，包括BDNF在内的多几种神经营养因子例如BDNF（货号10908010），CNTF（货号PHC7015），和GDNF（货号PHC7044）也可适用于相关研究。

历史上我们一直提供高品质的Gibco^™ 重组蛋白，主要包括细胞培养过程中常用的生长因子，细胞因子和趋化因子。为了拓展我们的重组蛋白套装范围，我们与Sino Biologcical合作，来为用户提供1500种左右的重组蛋白（Thermo Fisher Scientific与Sino Biological联合品牌）。Sino重组蛋白主要有四大优势：（1）包括粘附蛋白，细胞因子，趋化因子，生长因子，流感蛋白，蛋白酶，磷酸酶，转录因子，通道蛋白和受体在内的广泛选择；（2）具有竞争力的价格；（3）为每一种蛋白产品提供更多种广泛的包装尺寸规格和最后（4）大多数由哺乳动物细胞所表达，90%由人体细胞系表达，这样有助于就可确保蛋白产品具拥有正确的哺乳动物翻译后修饰。

由于Sino重组蛋白通常在以缓冲液中的冻干形式提供，我们一般推荐您使用双蒸水以0.2 mg/mL的浓度来进行溶解（除非专门说明需使用另一缓冲液进行溶解）。将分装好的冻储存液分装储存于–20°C条件下。

Sino重组蛋白一般以冻干粉的形式提供，我们推荐您将其储存于–20°C条件下。在按照推荐方式保存的前提下，产品保质期从收货日开始，为期一年。

由于90%的Sino重组蛋白是在人体细胞中作为分泌蛋白生产出来的，因此它们在很大程度上保留了天然的构象和生物学活性。生长因子，细胞因子，趋化因子和分泌型酶类等胞外分泌蛋白特别适用于这一点。对于一些Sino重组蛋白，使用了基于细胞的检测分析或功能性ELISA分析对其生物学活性进行了检测，产品页上也会提供相应的ED50值。

功能性ELISA是一类以ELISA形式进行的、基于体外配体结合的分析法。该方法用于检测目的蛋白与其天然结合物配体之间（如生长因子与其受体）的结合能力。如果在该检测中生长因子能够与其天然受体相结合，则该生长因子很可能是具有功能的。ED50为OD值读取过程中能够提供50%最大信号强度的生长因子浓度（在包被了受体的平板上）。

尽管在两种分析方法中较低的ED50值都意味着较高的生物活性，但这两个数值之间无法直接相互换算。因为功能性ELISA中的ED50表示的是某一生长因子或细胞因子能够获得与其受体间50%最大结合强度的浓度，这一浓度并不一定是能够在目的细胞中产生50%最大生物反应的浓度。此外，基于细胞的检测分析中的ED50值随着所用指示细胞的改变而发生显著变化。基于功能性ELISA获得的ED50值不会有那这么大的波动。

有些sino重组蛋白没有提供生物活性数据。在大多数情况下,这表明没有进行生物活性测试，但它并不一定意味着蛋白是没有活性的。在没有生物活性数据的情况下，这些蛋白可用做蛋白质分子量标准，蛋白免疫印记阳性对照（如果是全长的重组蛋白）或免疫原。其它可能的用途是配体结合试验或ELISA的标准品。