干细胞培养支持 — 问题排查

培养于其它无血清培养体系，例如mTeSR^TM培养基+ BD Matrigel^TM基底膜基质，或Gibco^TMStemPro^TMhESCSFM+Gibco^TMGeltrex^TM基质中的细胞，也能够成功培养于Essential 8培养基+VTN-N的组合体系中。此外，在饲养层细胞+Gibco^TMKnockOut^TM血清替代物中培养的PSCs经证明也能够培养于Essential 8^TM培养基+VTN-N的组合中。不过在将培养基体系更换为Essential 8培养基+VTN-N的组合之前，细胞必须经手工或用EDTA溶液进行传代。

可以。在mTeSR^TM培养基+BD Matrigel^TM基底膜基质条件下培养并冻存的PSCs细胞可复苏至Gibco^TM Essential 8^TM培养基中并种植于VTN-N基质上。某些细胞系复苏至冻存前的生长培养基及基质中可能会效果更好。在随后的下一次传代过程中，就可使用EDTA将这些细胞传代至Gibco^TM Essential 8^TM培养基+VTN-N的组合中了。

我们推荐用户在实验中一直使用H9或H7胚胎干细胞系作为对照。我们推荐用户针对难于分化的iPSC细胞系进行细胞密度的调整或延长诱导时间。

基于您所用细胞类型，可预期在转导后24-48小时观察到某种程度的细胞毒性，50%以上的细胞都可能受到影响。这表明细胞接受了大量病毒，并表达外源基因所致。我们推荐您按照实验方案中的步骤进行持续培养。请注意，Invitrogen^TMCytoTune^TM 2.0试剂盒中所包含的全新载体骨架表现出比原始版本的试剂盒更低的细胞毒性。此外，由于2.0试剂盒仅需要三个载体（相比原试剂盒中的四个载体），因此通常情况下毒性更低。

在我们测试过的细胞克隆中，我们发现10次传代后有10%左右的细胞仍含有病毒。实验结果显示c-Myc载体在细胞中滞留的时间相比其他载体更久。Invitrogen^TMCytoTune^TM-iPS仙台病毒重编程试剂盒包含了温度敏感的c-Myc变异载体，能够更方便地实现清除操作。如需清除c-Myc，请将iPSC细胞在38–39°C孵育5天。用户需要注意iPSC细胞的敏感性，因此我们只推荐对传代10次以上的（含仙台病毒）iPSC细胞系执行升温操作，同时您应已通过RT-PCR技术确认过您的细胞中不含Oct4、Sox2和Klf4（这些载体不含温度敏感性的突变）。之后您就可通过升温来去除c-Myc基因了。

丙戊酸通常被认为能够提升慢病毒等整合性病毒系统的重编程效果。但其对CytoTune^TM试剂所介导的重编程似乎没有促进效果，因为仙台病毒是一种非整合性的RNA病毒。

请注意Invitrogen^TMCytoTune^TM-iPS仙台病毒重编程试剂盒（货号A13780-01，A13780-02）已经停产。

这里列举了一些可能导致您培养细胞失败的原因：

• 不正确地储存细胞：这些细胞应保存于液氮中。
• 未使用推荐的培养基：Gibco^TM H9来源的NSC（货号N7800）和Gibco^TMStemPro^TM NSC（货号A15654或A15655）两种产品所使用的完全型培养基具有不同的配方。StemPro^TM NSC的培养基中需添加额外成份（肝素和抗坏血酸）。
• 不正确地复苏细胞：请勿在37°C条件下化冻细胞超过2分钟。细胞一旦化冻，应立即移至50-mL离心管中，之后在不断摇动离心管的过程中逐滴加入（每秒一滴左右）预热的完全型培养基。
• 化冻细胞后未对细胞活力进行计数和未正确种植细胞：您需要使用台盼蓝计数细胞活力。每管中的细胞至少达到1 x 10E6活性细胞/mL。对于H9来源的NSCs细胞而言，推荐以大于1 x 10E5活性细胞/cm²的密度进行种植。对于StemPro^TM NSC细胞而言，推荐以大于7 x 10E4活性细胞/mL的密度进行（悬浮）培养。
• 培养板未经正确包被：对于H9来源的NSCs进行贴壁培养而言，您需要依照包被说明书中的方案来应用Gibco^TMGeltrex^TM基质，纤连蛋白或L型多聚鸟氨酸/层粘连蛋白对组织培养板进行正确包被。对于StemPro^TM NSC细胞而言，我们推荐您进行悬浮培养，因为贴壁培养可能会导致细胞分化。

NSC不会被神经元特异性的标志物所染色。如果发现细胞被染色，则可能是由于抗体的非特异性所导致的。我们推荐您对抗体特异性和染色方案进行检查：

• 对第一抗体进行滴定，以找到最佳的抗体工作浓度。
• 调整破膜方案，因为高浓度的破膜剂会导致高背景。
• 使用足量的封闭液——如5-10%的血清——来封闭非特异性的着色。
• 包含同型（抗体）对照。

这些细胞非常娇弱。我们建议您依照手册中的操作步骤，并使用合适的培养基。快速化冻是健康培养的关键。这有一些需要考虑的关键项：

• 在使用前，所有的实验器材都应经过培养基的预先润洗。请勿使用PBS，DPBS或HBSS进行润洗，因为它们不含蛋白。
• 迅速复苏细胞，不要将细胞暴露于空气中。
• 首先将细胞移至预先润洗过的试管中，之后缓慢地逐滴加入培养基。不要向细胞一次性加入全量的培养基，这一操作可能引起渗透压休克和细胞活性降低。
• 使用预热的完全型生长培养基，并以正确的细胞密度进行接种。
• 对于某些细胞培养而言，基质包被是必需的。
• 请勿离心原代神经细胞，它们在冻存后的复苏期极为脆弱。

神经诱导失败有几种可能的原因：

• 高品质的hPSC细胞对于成功完成神经诱导至关重要。在神经诱导前去除已分化和部分分化的hPSC细胞。
• 在铺板后续用于诱导的hPSC细胞之前，我们推荐用户对细胞进行计数，因为过低或过高的细胞汇合度都将减低诱导效率。诱导实验的推荐铺板密度为2–2.5 x 10E4个细胞/cm²。
• 应铺板细胞团（而非单个细胞的悬液）来进行诱导。
• 为了增加诱导效率，可在hPSC传代时使用10 µM ROCK抑制剂Y27632进行过夜处理，以避免细胞过多死亡。

• 请检查是否在培养细胞的过程中使用了正确的B-27^TM添加剂。
• 通过检查B-27^TM添加剂的保质期来了解该产品是否过期。
• 检查所用含B-27^TM添加剂的培养基是否为新鲜配制。在4°C保存条件下，含添加剂的培养基仅在两周内保持稳定。
• 检查B-27^TM添加剂是否暴露在过热的条件下。化冻后的B-27^TM添加剂不可暴露于室温（或更高温度条件)下超过30分钟。
• 检查B-27^TM添加剂是否被反复冻融多次。化冻后的B-27^TM添加剂在4°C条件下应在1周内使用。
• 检查B-27^TM添加剂的外观。本品应为透明的黄色液体。绿色外观意味着添加剂已变质。