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DNA难以溶解最常见原因是DNA沉淀被干燥过度。DNA沉淀干燥一定不要超过5分钟。使用真空干燥设备除去洗涤液可能导致DNA沉淀干燥过度。真空干燥设备在抽走DNA沉淀中的空气时,也很容易导致DNA沉淀干燥过度。应避免使用任何类型的真空干燥设备除去DNA沉淀中的洗涤液,并将干燥时间限制在5分钟以内。如果您遵从以下简单建议,则可避免许多核酸溶解的问题。
使用灭菌棉球除去试管壁上的乙醇液滴。其他乙醇可通过使用灭菌毛细移液管尖接触DNA沉淀而去除。多余的乙醇将被毛细作用吸到移液管内。DNA沉淀中残留的乙醇不会产生负作用。通常,在DNA沉淀完全干燥前加入TE缓冲液或8 mM NaOH,可解决DNA溶解问题。DNA沉淀会在孵育5-10分钟后溶解而变透明。为了完全溶解DNA,可在定量前使用移液器反复吹打DNA溶液。
如需将干燥过度的DNA团块溶解,可以将其置于冰箱,并定期用移液器吹打至DNA沉淀变为透明并完全溶解于溶液中。
多糖为水溶性的,可随RNA进入水相。另外,在非过度干燥的情况下,受到污染的RNA和DNA沉淀比非常纯的沉淀更易溶解。在8 mM NaOH中不溶解的团块,也不会溶解于苯酚/氯仿溶液。
以下是DNA得率很低或者DNA发生降解的几种可能的原因:
通常,吸光度低是由苯酚污染所致。可以使用含0.1 M柠檬酸钠的10%乙醇进行洗涤。提取后有苯酚残留并不罕见,提取物的A280值比预期的更高,会造成A260/A280比值较低。我们推荐采取二次乙醇沉淀去除残留苯酚。这也能去除多余的盐。完成上述步骤后,如果试管有苯酚的味道,则再次沉淀DNA。这一步很重要,因为苯酚会抑制下游的酶反应。
如果水相完全去除并向样本中加入乙醇,乙醇会因密度较低而位于TRIzol试剂的上方。如果未充分混合酒精及有机相就对样本进行离心,则在离心后乙醇位于TRIzol试剂的上方,DNA仍处于中间相,而TRIzol试剂位于底部的红色有机部分。如果没有恰当混合乙醇,则应继续混合样本,然后离心并继续完成DNA分离实验方案中的步骤1。
如果不慎加入了70%乙醇,则可能在有机相上方出现小体积的水相。由于实验方案所用洗涤液含有不超过30%的水,因此,在有机相上方出现的水层不会超过0.3mL的30%(90 µL)。您可在继续分离前尝试去除水相,但是DNA得率可能会降低。
如果在RNA分离过程中出现水相与有机相分离不完全,也会出现这种情况,原因主要有四个:1,氯仿混合不充分;2,样本离心时转速不合适;3,未达到需要的离心时间,4,离心温度错误。这些原因导致最终将从样本中回收到明显少于600 µL的RNA水相。液相分离问题通常出现于使用涡旋振荡来混合试管中的氯仿时。由于TRIzol试剂和有机相之间较大的密度差异,这些溶液很难完全被混匀,因此只能回收部分水相。当加入乙醇并再次充分混合样本时,将再次出现水相和有机相的分离,并且水相会出现于样本上方。
可以,这种情况是由试剂中的染料所致,并且可能取决于储存试剂的体积。颜色改变不会影响性能。
不会,8 mM NaOH不会影响DNA的完整性。实际上,DNA在弱碱性pH(>7)环境中最稳定。您会发现,纯化的DNA在水中的溶解性并不是很好,在Tris缓冲液中的溶解度更差。(由于空气中的CO2溶于水,水的pH通常低于7。弱酸性的水实际上会引起DNA降解。)8 mM NaOH的pH约为9,一旦DNA溶解后,可以再用TE或HEPES调整pH。(由于暴露于空气时,二氧化碳会溶于溶液中,溶液也会随时间而变为中性。)
若您得到的A260/A280比值很低,应考虑以下几方面:
您可以尝试将样本溶于8 mM NaOH中,在37°C孵育过夜以帮助DNA的溶解。您也可以尝试在45°C孵育15分钟。
如果在分离DNA前使用磷酸盐缓冲液洗涤细胞或组织,则磷酸盐可能会抑制限制性内切酶。我们推荐向DNA溶液中加入DNAzol试剂,使用0.5倍体积的95%乙醇再次沉淀。沉淀后,使用95%乙醇洗涤2次,短暂干燥,并重悬于8 mM NaOH中。
如果DNAzol试剂的用量过少,则可能在加入乙醇后出现两相。应加入更多DNAzol试剂并继续实验。
颜色是因为加入DNAzol试剂前发生了细胞裂解。红色是由血红蛋白产生的。这种污染会导致PCR出现问题,因此,必须在乙醇洗涤步骤前去除颜色。以下是导致污染的可能原因:
使用蘸有少量温和清洁剂、肥皂水或乙醇的软布或纸巾擦拭磁力棒。
若96孔磁棒套未插入到固定器中,实验方案不会启动。
如果起始物料过于粘稠,磁力棒将不能收集磁珠。应稀释样本,并检查样本是否已经正确匀浆和裂解。
如果在运行期间点击“停止”,则可暂停;如果再次点击开始,则继续运行。如果点击停止两次,则运行完全终止,无法从实验方案的中间部分开始运行。
这种情况有时会发生,但这不会影响得率,因为样本已经从磁珠中释放出来。
可能原因是塑料96孔磁棒套的设计使其轻微弯曲。这就是为什么96孔磁棒套是成对包装的,这样可以维持形状。您可以手动调整96孔磁棒套的主干的弯曲度,并再试一次。
关闭仪器,检查是否存在可见损伤。确认使用了正在运行的实验方案对应的正确磁头。如果仪器无可见损伤,则再次开启。这样做时,应重置仪器。如果问题立即再次出现,则关闭仪器,轻轻将磁头装置移动到其传播路径中心,随后再次开启仪器。如果问题依然存在,应拨打维修电话请求重置磁头。
可以,请订购货号4489112
请采用以下推荐步骤:
若仍出现相同的错误代码,尝试以下步骤:关闭仪器,移除程序卡,重新插入程序卡,重启仪器,在手动菜单中选择option 2,归还枪头。随后,在无试剂的情况下运行实验方案。
如果您的PCR管子保持打开的状态,并且PCR产物非常少,蒸发会造成分子排阻效应,导致回收效率低或者完全回收不回来。
一般可通过增加洗涤缓冲液体积来增加回收的最小片段的长度,同时确保长引物不会被洗脱。您必须通过一系列的梯度稀释实验来进行最适条件的优化。
ChargeSwitch包被的磁珠是惰性的,不会影响PCR使用。我们已经发现,多达10 µL磁珠不会对常规PCR实验产生负影响。超过~10 µL的过量磁珠会抑制PCR反应。一些特殊应用可能会受到磁珠影响,包括实时定量PCR反应或MALDI-TOF。在这些应用中,应重复实验方案中描述的最终洗脱结合步骤。
缓冲液已经过优化(通过使用毫摩尔级别的盐),从而避免蛋白质结合。我们的验证研究已经证明不会出现蛋白质结合。
出现这种情况的原因有多种:
得率低的原因有多种:
以下是为您提供的一些建议:
电泳时产生的高热量或凝胶电泳速度过快,会导致多条带的出现。在凝胶上分析洗脱的DNA时,分离所得的DNA以多条带的形式出现。在50°孵育以溶解凝胶片时,富含AT碱基的DNA还可能发生变性。如果发生这种情况,可在37°C孵育20-30分钟并反复涡旋振荡,以溶解凝胶。
仅限研究用途,不可用于诊断操作。