质粒DNA纯化支持——问题排查

可尝试如下建议：

• 确保质粒的结合是在室温（RT）下进行的。温度会影响结合溶液的pH值。确保所有其它的溶液也处于室温。
• 确认中和之后马上离心时不是在4°C进行。如果是，那么上清必须被平衡至室温然后才能用于上柱结合。我们发现如果裂解产物处于室温则DNA可以更好地和纯化柱的基质结合。
• 你可能使用了低拷贝质粒。检查质粒。
• 细胞收集步骤的培养基可能去除不完全，因此后续步骤的pH值受到影响。
• 在重悬步骤细胞团块可能没有被完全重悬。
• 纯化后的DNA可能在异丙醇沉淀和乙醇洗涤之后被过度干燥。仅需在空气中干燥沉淀。
• 在异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程中沉淀可能会丢失。小心操作此步骤，因为沉淀较滑。最好使用移液器移除醇溶液而不是将其倒出。
• 当进行BAC DNA纯化时（此时洗涤缓冲液W8中的NaCl从0.8 M提升至0.9 M），可能使用了过量的洗涤缓冲液W8。请参阅使用手册的BAC纯化部分。
• 试试用加热的洗脱缓冲液洗脱DNA。对于小于10kb的质粒，无需加热步骤。对于10-30kb的质粒，可选择加热（65–70°C），加热后洗脱效率可提高~20%。对于大于30kb的质粒，建议进行加热洗脱，加热后洗脱效率可提高~50%。进行一步额外的洗脱步骤可以将洗脱效率提高10%。
• 如果洗脱后的DNA中有一些不溶物，它有可能是树脂颗粒（树脂粉末）。这些不溶物可以通过12,000 x g室温离心1分钟去除。
• 你也可以试试在中对数生长期（大约在OD590为0.8–1.0时）时向菌液中加入氯霉素。

请检查质粒是否是通过乙醇沉淀并在洗脱后进行了洗涤。如果质粒含盐过多或pH值过高则会引起抑制效应。

要降低RNA污染可尝试如下建议：

1. 将沉淀缓冲液（N3) 的体积提高10%。（这将降低结合到树脂的RNA量。）
   
2. 将洗涤缓冲液（W8）的盐浓度从800 mM NaCl提高到860 mM NaCl，即向每100mL洗涤缓冲液中加入0.35 g NaCl。（这样做将从树脂上洗涤除去更多的RNA）。
   （注意：上述每一步改变都能显著降低RNA污染。这些步骤结合起来基本可以除去所有RNA污染。）

• 确保向重悬缓冲液中加入了RNase A并完全溶解。
• 确保向重悬缓冲液中加入的RNase A没有在4°C保存超过1年。
• PureLink HiPure Filter Midi和Maxi试剂盒可以更彻底的去除细菌裂解物从而降低RNA污染。
• 如果RNA污染仍然存在，可以提高重悬缓冲液中的RNase A浓度。RNase A浓度可以提高至400 µg/mL。这样做在纯化低拷贝质粒或其它单拷贝DNA类型如BAC时尤其有用。
• 当提取低拷贝质粒时由于使用了大量的细菌所以更容易产生RNA污染问题。

排除细菌培养物的问题：

• 纯化柱中可能加入了过量的细菌。确认细菌培养达到了合适的OD值并且所使用的体积符合试剂盒的规格。菌液密度大约为10^9 cells/mL或600 nm吸光值(A600)在1–1.5时是合适的。确认生长时间：37°C生长16至24小时足够获得预期的OD值。确认所使用的培养基，因为TB或高营养培养基会产生高密度菌液从而将导致裂解不完全。
• 确认加入的菌液和缓冲液的体积（用RNase A重悬时，裂解以及中和步骤）。对于>200 mL的菌液，应当增加所用的缓冲液体积。检查加入重悬缓冲液的RNase量。对于高密度或大体积的菌液，可以加入额外量的RNase A至400µg/mL，如前所述。

如果发现DNA污染，那么可能是细胞裂解步骤和中和步骤出现了问题。有可能中和步骤的混合物没有被正确离心，或者在裂解步骤混合样本时过于激烈。

当溶液过冷时通常会出现这种情况。如有必要，可以将溶液短暂加温至37°C直至沉淀溶解。

我们有时会观察到这种现象。这些颗粒不会影响DNA的质量。这些颗粒可以通过在12,000 x g离心1分钟去除。

当质粒DNA出现切口和/或永久变性时，就会有额外的条带出现。在电泳时，带有切口（共价键断裂）的质粒DNA比超螺旋DNA的迁移速率慢。少量的此种类型的DNA存在是正常的而且并不影响下游应用。永久变性的DNA比超螺旋质粒迁移更快并且可能不适合下游应用。确保裂解反应不能超过5分钟。

HiPure试剂盒可以从DNA中去除包括内源性核酸酶在内的所有蛋白。对于硅膜法的PureLink Quick Plasmid Miniprep试剂盒，我们建议使用洗涤缓冲液W10进行一步额外的洗涤步骤以去除内源性核酸酶。这一溶液与HiPure系统不兼容，不能用于HiPure试剂盒。此外，可以将洗脱后的溶于TE中的DNA在70°C加热10分钟。这样做可以使任何污染的核酸酶发生热失活。

是的，我们推荐购买PureLink HiPure BAC缓冲液试剂盒（Cat. No. K210018）。你需要加入的RNase量将少于该试剂盒内R3缓冲液瓶上标明的RNase量。瓶上标明加入5.6mL的RNase A。这对于BAC纯化实验是正确的量，但是，如果你进行的是标准质粒提取，那么应加入1.4 mL RNase A。

吸光值测定经常遇到的一个问题是样本的浑浊度。（这可能是由于纯化柱内的树脂残留引起的。）如果在比色皿内有不溶物（经常是肉眼不可见的），大部分的UV光将不被吸收而是被散射，导致出现一个假性的高UV吸收值（例如在260或280 nm）。如果你的A260很高，我们建议你检测A320以确定是否在样本内存在树脂。你也可以试试离心或过滤（使用0.2 µm滤膜）你的样本以去除残留的树脂然后重新测定浓度。

我们强烈建议使用试剂盒提供的洗脱缓冲液，并且不建议用水进行洗脱。如果你需要使用任何其它的缓冲液进行洗脱，请确保使用pH 8.5–9.0的缓冲液以实现DNA的高效洗脱。

产量是可能变化的，但是每次纯化应当在500 µg至1 µg之间。这一范围是由进入仪器的空气气压和气流，细菌量（由于体积、菌种、培养基类型不同而不同），菌液生长时期，质粒大小，以及质粒上的ori（复制起始位点）导致的。

最常见的两个导致低产量/零产量的原因是：低空气气压和/或低流速（仪器要求空气流速在90 psi时达到4 cfm）以及菌液过量（我们建议使用100–125 mL OD 2.0的LB培养物）。

出现这一现象可能有以下三个原因：
空气流动的变化会降低从沉淀膜上回收的质粒DNA量。预期的回收洗脱体积应该在800 至1000 µl之间。

如果纯化的是很大的质粒，那么DNA的大小可能会阻碍从沉淀膜上回收洗脱液。我们已经确认，如果质粒很大或其大小超出了推荐的范围，那么洗脱体积（和产量）将会减小。

如果你使用丰富培养基（TB，Circlegrow等），那么洗脱体积过低可能是由于系统过载从而导致在前几个循环中真空泵的负载过高，试剂吹回到试剂托盘，吹出一些洗脱体积。房间气压降低也会导致洗脱体积减少。

这些错误信息是阀门错误信息。错误编码表明哪个阀门坏了。

通常，"valve=1/Error Code 52=1”意味着空气供应问题，因为阀门1（valve1）通常会因为空气气压或流速过低而出现故障。如果你看到这一错误信息，请测量空气气压和流速。一旦确认，关闭电源并重启机器。仪器将通过自检测试。但是，如果当空气气压和流速满足仪器要求时问题仍然存在，则意味着仪器需要修理，因为空气管线内存在液体或固体残留。造成此问题的最常见原因是使用了过高营养的培液或过多的细菌量。

对于 “valve=5/Error Code 52=5”或其它任何编码不是1的错误信息，可以尝试重启仪器。如果同样的阀门错误再次出现，通常意味着这个特定的阀门出现故障。如果在重启之后，你看到一个不同的错误编码，请检查空气气压和流速是否满足仪器要求。

这通常是由于空气流速的突然下降（空气系统的问题，通常不是仪器自身的问题）引起的。在BenchPro 2100运行程序中，裂解步骤和洗脱步骤需要较高的空气气压，所以这一错误信息通常出现在这两个步骤。如果这一错误出现在裂解步骤，我们建议从头重新开始，使用新的菌液，新的纯化卡，以及新的试剂槽。原样本将损失。

如果这一错误出现在洗脱步骤，可以看看是否得到了一些洗脱下来的DNA。希望有一些DNA已经被洗脱下来（通常大部分DNA在洗脱步骤的前1-2分钟已经洗脱下来）。如果这一错误正好在洗脱步骤开始前出现，而洗脱管内还没有任何溶液，你可以清空所有试剂槽并重新在正确的试剂槽内加入1.5 ml TE或水，然后使用同一试剂槽和纯化卡设置程序并重新和运行实验步骤。

请按顺序进行以下步骤以解锁抽屉：

1. 关闭仪器电源。
   
2. 移除纯化卡（如果已经插入的话）。
   
3. 向内按压抽屉（按住仪器的后部）以确保锁定装置已经松开，然后放松压力。
   
4. 打开仪器电源。
   
5. 再次向内按压抽屉（按住仪器的后部）试图将门打开。
   软件在重启过程中会向门锁定电磁阀发出解锁信号。如果在重复步骤1到5数次后门仍然不能打开，请联系我们的技术支持团队。

在运行中出现这种情况是完全正常的，我们经常看到，但是它不会对仪器运行带来任何问题。你可以使用穿刺工具将试剂槽顶部的孔扩大，这有助于让液体回流到试剂槽内。如果向系统中加入了过多OD值很高的培养物，则试剂槽铝膜的顶部会出现更多的固体残留，因此，检查是否是这种情况并减少菌液使用量。在长时间使用仪器之后，你可能会看到在抽屉的顶部甚至有时在在仪器的轨道上出现固体残留物，但是这不会损伤仪器。但是，如果这种情况确实造成了困扰，我们建议使用一些Kimwipes纸巾，将纸巾用70%乙醇润湿，然后将残留物擦拭除去。