RNA样本收集、保护和分离支持 – 问题排查

将溶液加热至37°C，保持15分钟，并搅拌溶解。

改善RNA分离结果的10个最佳方法：
1) 立即灭活细胞内源性RNase。
2) 使用合适的细胞或组织储存条件。
3) 充分匀浆样品。
4) 在RNA分离前预处理匀浆物，以去除干扰物。
5) 为样品选择最佳的RNA分离方法。
6) 进行DNase处理。
7) 减少接触环境中的RNase的机会。
8) 根据下游应用选择合适的沉淀方法。
9) 在合适的溶剂中重悬RNA。
10) 保存分离后的RNA的方法要得当。
请点击此处，阅读每条建议的详细内容。

有2种方法可以去除不溶性物质：

1. 仅分离RNA：如果经过匀浆并在室温静置5分钟后有很多不溶性物质，则可在加入氯仿前通过4°C12,000 x g离心10分钟去除不溶物（应出现透明的上清液和果冻样沉淀）。将上清液转移至新管子，并继续进行下一步。注意：若后续计划进行DNA分离，则不应这样做。
2. RNA和DNA分离：如果经过匀浆并在室温静置5分钟后有很多不溶性物质，则可将匀浆物通过聚丙烯滤膜以去除可能影响DNA沉淀的不溶性物质。

如果在这一步不慎使用了异丙醇替代了氯仿，则加入更多异丙醇沉淀所有物质，随后使用TRIzol试剂重悬沉淀并遵循指定的实验方案。RNA得率会降低，但仍有可能在下游RT-PCR得到产物。以下是详细的实验方案：

1. 加入更多异丙醇，使异丙醇总体积与所用的TRIzol试剂体积相等。在4°C以7,500 x g离心10分钟。
2. 倒出上清液；将比较紧实的沉淀晾干（不需要完全干燥，只是减少异丙醇体积）。
3. 以微升为单位估计沉淀的体积；加入至少15–20倍体积的TRIzol试剂（如100μl沉淀，则至少加1.5mL TRIzol试剂）。
4. 使沉淀充分破碎（可能需要使用手动匀浆仪）。将溶液放置于室温下10-15分钟；约每5分钟手动振荡，保证沉淀均匀分散。
5. 继续执行TRIzol实验方案（即，加入氯仿）。此举将无法得到最佳结果，但仍有可能在RT-PCR中得到产物。
   也可以额外加入2倍体积的TRIzol试剂，以补偿过多的异丙醇体积，随后根据TRIzol试剂的总体积加入更多氯仿。该方法更迅速，但会使RNA中含有更多DNA污染。

如果不慎加入的氯仿体积比需求量多出很多，则应加入更多TRIzol试剂，将氯仿与TRIzol试剂的比例维持在0.2mL：1 mL。如果加入了过多氯仿，会将DNA和蛋白质带入水相中。

请查看以下RNA得率较低或得到降解的RNA的原因：

• 在最后的乙醇沉淀步骤中，可能使用过SpeedVac™系统浓缩RNA或冻干过RNA。完全干燥的RNA溶解性降低。此外，如果使用了过高的离心速度（高于12,000 x g），也会导致RNA/DNA难溶解。
• RNA沉淀可能未完全溶解。为提高溶解率，使用移液器将沉淀在SDS溶液或DEPC水中反复吹打，然后加热至50–60°C。样品可能富含多糖或蛋白多糖。如果是这样，则异丙醇沉淀步骤应使用0.25体积异丙醇和0.25体积高盐溶液。
• 加入TRIzol试剂前，洗涤了细胞。在加入TRIzol试剂前洗涤细胞，会增加mRNA降解的几率。
• 样品未完全匀浆。
• 从动物或其他来源取出组织后，未立即分离RNA或冻存。
• 组织未完全裂解；如果在加入氯仿前离心，会出现白色粘液状沉淀。如果出现棕褐色沉淀，则表示细胞未完全裂解。
• 如果使用研钵和研杵研磨组织，则RNA和DNA可能非特异性粘附在研钵和研杵上。最好使用玻璃匀浆仪和Teflon研杵；向匀浆仪中加入TRIzol试剂，然后加入冻存的组织并开始匀浆。
• 分离后的RNA可能被储存在–20°C，而不是–70°C下。
• 曾使用胰酶裂解组织培养细胞。
• 连续不断长时间在小体积样品（如，1 mL）中匀浆可能引起样品升温；这会导致组织中RNA降解。匀浆时应冷却样品，并采取间断性匀浆（与连续匀浆相反）。
• 定量前，样品的保存液和稀释液不同，会使OD读取结果不同。这也会导致得率低的假象。
• 过多的RNAlater溶液（>0.05 mL）会降低RNA回收率，导致相分离出现问题。

在最初的分离步骤后，一部分中间相随水相一起被移出了。出现这种情况的原因有多种。

• 加入到样品中的TRIzol试剂量不足。通常，每0.05 g组织或每10 cm2培养皿应使用1 mL TRIzol试剂。
• 原始样品中可能含有痕量的其他有机物质（乙醇、DMSO等）。
• 在RT-PCR前，应使用扩增级纯度的DNase I处理RNA。
• 在首次匀浆后、氯仿提取前，可能有未被离心除去的不溶物。
• 从转染了质粒的细胞中分离的RNA中可能含有DNA污染，则有可能是质粒的污染，因为在向TRIzol试剂中加入氯仿后，不是所有质粒DNA都可能进入到中间相/有机相。若使用RT-PCR检测转染质粒的细胞中基因的表达，则需要进行DNase I处理。

• 样品在过少的TRIzol试剂中匀浆。
• 匀浆后，未将样品在室温下保存5分钟。（这可能导致核蛋白未解离）。
• 最终得到的RNA沉淀未完全溶解。这可能是因为RNA沉淀干燥过度（如果沉淀是透明的而非白色，则表示干燥过度）。为了使沉淀完全溶解，应加热至55–60°C维持10–15分钟，并反复吹打。
• 可能存在苯酚污染。这可能是因为样品是在室温下离心，而非4°C；苯酚在室温下更易溶于水相。如果在270 nm有吸光度（由于存在苯酚），则可通过乙醇沉淀除去样品中的残留苯酚。
• 胍类约在240 nm处有吸光值。苯酚有2个吸收峰：一个约为275nm，另一个宽峰范围为220 nm以下至240nm左右。如果在此范围内观察到很大的峰，则建议再次沉淀和洗涤。为防止发生这种情况，我们还是建议加入氯仿后在4°C的进行相分离。
• 可能有氯仿残留；应再次沉淀。
• 在一些溶于水的样品中，水的酸性或低离子含量可能导致A260/A280比值较低。若样品溶于TE中，并使用TE缓冲液（或1–3 mM Na2HPO4，pH ~8.0）调零分光光度计，则该比率会升高。核酸的摩尔消光系数是在中性pH条件下得到的，这表明在中性pH条件下260nm处的吸光度最高。
• 不同的分光光度计会带来A260/A280比值差异（可能原因是，在260 nm“调零”后，仪器在280 nm的“调零”方法会产生不同的A280值）。在这种情况下，我们建议使用不同的分光光度计。

在样品中加入糖原有助于改善得率并能和RNA一起沉淀下来（糖原是水溶性的）。聚丙烯酰胺也可用作沉淀少量RNA的载体。另外也可使用鲑鱼精DNA，在沉淀水相时加入。

若已知样品具有高含量的蛋白多糖和/或多糖（如大鼠肝脏、大鼠主动脉、植物），对RNA沉淀步骤做如下改进应该可以从分离的RNA中除去上述污染物：

向每1 mL TRIzol试剂匀浆得到的水相中加入0.25 mL异丙醇，随后加入0.25mL高盐沉淀液（0.8M柠檬酸钠和1.2 M NaCl；无需调整pH）。将溶液混合、离心，并继续使用实验方案中的方法分离。

这种改进的沉淀方法可有效沉淀RNA并维持蛋白多糖和多糖的溶解性。为了从多糖含量很高的植物材料中分离纯化RNA，在使用改进沉淀方法的同时，应对初始匀浆液进行额外的离心。通常，在多糖或蛋白多糖污染不会带来问题时，我们不推荐使用高盐沉淀法，因为这个额外步骤并不会带来任何显著优势。一般来说，在多糖或蛋白多糖污染不会带来问题的情况下纯化RNA样品时，使用或不使用高盐沉淀液，总RNA得率都一样。RNA谱会有细微变化，体现在tRNA量的轻微降低。高盐沉淀会使样品中的tRNA减少。

以下是我们的建议：

1. 上游组织获取和组织样品制备——尽可能在手术切除后1小时内固定组织。完成固定步骤前，可能会发生大量RNA降解。最佳固定时长为12-24小时，应使用中性福尔马林或多聚甲醛溶液。在包埋前，固定组织应完全脱水。
2. 整块储存——尽可能整块保存，无切割面，以防止暴露于大气中的氧气、水以及光、感染（真菌、昆虫等）等其他环境因素造成持续伤害。
3. RNA分离时组织类型、大小和用量的选择——推荐的组织厚度为10–20 µm。切片数取决于组织类型（影响细胞密度）和表面积（推荐大小：50–300 mm2）。过多的起始材料可引起滤膜堵塞，产生较差的得率。
4. 避免使用过量的石蜡进行组织包埋——尽可能在开始纯化步骤前去除过多的石蜡。对于二甲苯纯化法，室温下2次二甲苯处理应足以完全脱蜡。如果需要，可采取更严格的处理，37–55°C最多孵育30分钟。在二甲苯脱蜡后，一定要完全移去100%乙醇，并在2次100%乙醇洗涤后干燥沉淀。磁珠法利用新型化学反应处理石蜡，将输入量限制到20 µm的切片。
   点击 此处，阅读关于从FFPE组织中分离RNA的更多信息。

• 这在皮肤样品中很常见。据推测，皮肤样品中含有脂肪，脂肪微粒在离心时会漂浮。在皮肤样品中，微粒会粘附黑色素，使水相产生颜色。脂肪微粒也可从TRIzol试剂中粘附色素，产生浅粉色。如果认为样品中含有脂肪，则在加入氯仿前对TRIzol试剂处理的匀浆液进行离心。脂肪会在上清液顶层形成透明层；应使用移液器将这一层移走并丢弃。
• 若样品含有很多血液，则水相可能会变浑浊和/或淡黄色（可能由于血红蛋白含有铁）。如果离心机不是低温，有机相会变成深栗色；其中一些颜色会进入水相，使水相变为橙色或黄色。
• 出现浅粉色水相的原因也可能是样品过度稀释（即，样品与TRIzol试剂的比例> 1:10）或者样品中含有过多的盐和蛋白质。这会引起过早的相分离，可通过在样品中多加入一点TRIzol试剂进行补救。从浅粉色水相中分离的RNA，很可能存在DNA污染。

沉淀最可能是多糖或细胞膜；DNA应该在中间相。在含血液的样品（如，肝脏）中，可能在沉淀顶部出现可见的红色粘稠层。这最可能是血液产物，不应与上清液一起转移。

降解的RNA可引起260 nm处的吸光度升高。

为防止滤膜被粘稠样品或含大量组织的样品堵塞，应先以10,000–15,000 x g的转速离心净化，并将上清液转移到新管子中，再向裂解/结合液中加入乙醇。

RNA质量/纯度差通常是由于以下原因：

• RNA部分降解：应使用新鲜的组织或细胞，或在无法立即冻存组织的情况下使用RNAlater溶液保存样品。
• DNA污染：如果样品含有机溶剂、强力缓冲液或碱性溶液，我们推荐在8°C下进行液相分离。
• A260/A280比值低（<1.6）：这表示TRI Reagent用量不足。在室温下孵育匀浆液5分钟，有助于核蛋白从RNA上解离。苯酚污染也会引起吸光度比值降低。

匀浆不完全或加入乙醇后发生沉淀分散，会导致RNA纯化柱堵塞。可通过离心净化匀浆液，除去所有颗粒物或粘稠物。在匀浆液中加入乙醇后要使形成的所有沉淀完全分散。仅将上清液上样到RNA纯化柱上，以避免堵塞。

低RNA得率可能是由于以下原因：

• 裂解和匀浆不完全：应确保在每毫升裂解液中加入10 µL的2-巯基乙醇、所有步骤在室温下进行、减少起始样品量、使用合适的匀浆方法和/或将组织样品切成小块，以保证组织完全浸没于裂解液中。
• 起始样品质量差：使用新鲜的样品，收集样品后立即处理。
• 可能未在洗涤缓冲液II中加入乙醇。
• 可能使用了不正确的洗脱条件：在离心前加入无RNase水并孵育1分钟，遵循使用手册中的洗脱建议。您也可采取二次洗脱步骤，以回收更多RNA。

RNA可能被RNase污染。应确保使用了无RNase的设备，并经常更换手套。不恰当的处理也会导致RNA降解。应确保立即处理样品，并且在加入裂解缓冲液后快速进行裂解。最后，富含RNase的组织（如大鼠胰腺）可能需要加入RNase抑制剂或灭活剂以防止RNA降解，或需要加入更多的裂解缓冲液。

若纯化RNA中存在乙醇或盐，会抑制下游酶反应。应确保试剂盒中洗涤缓冲液的使用顺序正确，并在洗脱前去除洗涤缓冲液II的流穿液。将纯化柱放置到洗涤管中并以最大转速离心2-3分钟，从而使纯化柱完全干燥。

1. 确保从孔中移去了所有培养基。
2. 移去培养基后，使用相同体积的室温1X PBS洗涤。
3. 确保反应在室温下发生（如果将反应板置于冰上、将反应板快速转移至实验台或使用了冰冷的裂解液，则裂解反应可能不会达到室温）。
4. 将裂解液恢复至室温后，再加入到细胞。
5. 使裂解反应在25°C下持续8分钟。

可以，该产品具有1mL分装形式（货号 4402960）。

在无模板PCR对照中出现PCR产物，表示存在DNA污染。为控制污染，需要采取更为严格的步骤。

如果在没有反转录的阴性对照反应中出现PCR产物，而非无模板对照中，则表示RNA样品中仍存在基因组DNA，并且在实时PCR中扩增了基因组DNA。请参考以下建议：

• 确保DNase I完全混入裂解液中。
• 减少每次裂解反应的细胞用量。
• 使用室温下的裂解液裂解细胞，确保裂解反应在室温下发生。

也可尝试延长裂解反应的孵育时间至8分钟，和/或使用已经升温至25°C的裂解液裂解细胞。