Search Thermo Fisher Scientific
我们致力于成就您的成功。话不多说。查看我们针对常见问题场景的专家建议。
浏览以下相关问题:
实验新手?访问我们的
建议如下:
建议如下:
预染标准品具有与每种蛋白质共价结合的染料,这将导致标准品在不同的缓冲系统(即不同的凝胶)中迁移率不同。因此,使用预染标准品进行分子量估算将仅得出蛋白质的表观分子量。预染标准品可用于分子量估算、确认凝胶迁移和估算转膜效率,但对于需要精确估算分子量的应用,应使用非预染标准品。
褪色最可能是由于封闭/洗涤液中的洗涤剂将一些蛋白质从膜上洗脱造成的。染料本身不会从蛋白质上洗脱,因为它们是共价结合的。我们已经发现较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质,因此,为了获得绝佳的分辨率和蛋白质保留率,推荐使用0.2 µm代替0.45 µm的膜。转印后,可以用铅笔在膜上圈出预染条带,从而在封闭和处理后仍可辨认条带位置。
建议如下:
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
样品被煮沸 | 丢弃煮沸的分装样品。 |
使用的分子量标准品体积过大 | 加入较少的体积或使用前用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
凝胶上的分子量标准品的量不足 | 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议:
|
转印不完全或不理想 | 优化转印条件 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
样品被煮沸 | 丢弃煮沸的等分样品。 |
使用的分子量标准品体积过大 | 使用前加入较少的体积或稀释蛋白质上样缓冲液中的分子量标准品。 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
凝胶上的分子量标准品的量不足 | 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议:
|
转印不完全或不理想 | 优化转印条件 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
样品被煮沸 | 丢弃煮沸的样品。 |
使用的分子量标准品体积过大 | 加入较少的体积或使用前用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
凝胶上的分子量标准品的量不足 | 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议:
|
转印不完全或不理想 | 优化转印条件 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
样品被煮沸 | 丢弃煮沸的样品。 |
使用的分子量标准品体积过大 | 加入较少的体积或使用前用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。 |
储存缓冲液中的DTT氧化 | 加入新制备的DTT溶液使最终浓度达到100mM。 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
样品被煮沸 | 丢弃煮沸的等分样品。 |
使用的分子量标准品体积过大 | 加入较少的体积或使用前用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。 |
储存缓冲液中的DTT氧化 | 加入新制备的DTT溶液使最终浓度达到50mM。在95℃下加热10分钟。在室温下冷却并充分混合。储存于-20℃以备将来使用。 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
凝胶上的分子量标准品的量不足 | 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议:
|
转印不完全或不理想 | 优化转印条件 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
样品被煮沸 | 丢弃煮沸的样品。 |
使用的分子量标准品体积过大 | 减少分子量标准品体积 |
抗体浓度过高 | 优化抗体浓度 |
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
上样体积不足 | 在凝胶上添加更多体积的标准品 |
转印不完全或不理想 | 优化转印条件 |
二抗未识别分子量标准蛋白 | 确保使用与分子量标准蛋白结合的适当二抗。 |
二抗不是酶偶联的 | 确保在系统中使用适当的二抗 |
使用了小鼠单克隆一抗 | 使用更大体积的分子量标准品或使用SuperSignal增强型蛋白质分子量标准品(货号84786)用于小鼠一抗 |
这可能是由于染料前缘没有跑下凝胶或从印迹中去除。我们建议使染料前缘跑下凝胶或将其从印迹中去除。
以下是一些可能的原因和解决方案:
原因 | 解决方案 |
上样体积不足 | 在凝胶上添加更多体积的标准品 |
转印不完全或不理想 | 优化转印条件 |
二抗未识别分子量标准蛋白 | 确保使用与分子量标准蛋白结合的适当二抗。 |
二抗不是酶偶联的 | 确保在系统中使用适当的二抗 |
Primary antibodies with low starting concentrations may result in insufficient chemiluminescent detection of the western blot positive control bands. If the unstained 30 kDa and 80 kDa bands produce weak or no signal, spike the diluted primary antibody with the corresponding rabbit IgG or mouse IgG to a concentration of 1-5 µg/mL, prior to secondary antibody incubation. Follow with respective secondary (GAM/GAR) incubation to increase the intensity of western blot positive control bands in the iBright Prestained Protein Ladder.
仅供研究使用。不可用于诊断操作。