免疫印迹分析支持 - 故障排除

• 增加电压、电流或转印时间
• 凝胶和SDS-蛋白质复合物中的SDS会促进蛋白质从凝胶中洗脱，但抑制蛋白质与膜的结合。这种抑制作用在硝化纤维素膜上的强度大于PVDF膜。对于难以从凝胶中洗脱的蛋白质，如大分子量蛋白质，可在转膜缓冲液中加入少量SDS以改善转印效果。我们建议在组装三明治前将凝胶置于含0.02–0.04% SDS的2x转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X转膜缓冲液进行转印。
• 甲醇可去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，促进蛋白质与膜的结合，但对凝胶本身有一些不良影响，会降低转印效率。甲醇可能导致孔径减小、某些蛋白质发生沉淀以及一些碱性蛋白质带正电荷或变为中性。应确保转膜缓冲液的甲醇浓度不高于10–20%，并使用高质量的分析级甲醇。

• 降低电压、电流或缩短转印时间
• 应确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。
• 应确保转膜缓冲液的SDS浓度合适（若加入了SDS），SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。
• 检查膜的孔径和目标蛋白质的大小。小于10 kDa的蛋白质易于穿过0.45 μm孔径的膜。如果目标蛋白质小于10 kDa，则最好使用0.2 μm孔径的膜。

褪色最可能是由于封闭/洗涤液中的去污剂[去垢剂]将一些蛋白质从膜上洗脱[洗脱造成的]。染料本身不会从蛋白质上洗脱，因为它们是共价结合的。我们已经发现较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质，因此，为了获得最佳的分辨率和蛋白质保留率，推荐使用0.2 µm代替0.45 µm的膜。转印后，可以用铅笔在膜上圈出预染条带，从而在封闭和处理后仍可辨认条带位置。

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

电流异常升高的最常见原因是缓冲液。如果缓冲液浓度太高，会导致电导率增加和电流升高。如果不小心用Tris-HCl代替了转膜缓冲液所需的Tris base，也会导致高电流。Tris-HCl可使缓冲液pH降低，引起电导率和电流升高，从而导致过热。应检查转膜缓冲液及其试剂成分，然后重新稀释或重新配制缓冲液。

我们建议丢弃缓冲液，并在再次检查试剂和水的纯度后重新配制。不建议用酸或碱调节pH，因为这会使缓冲液的电导率升高，导致转印期间电流过高。

可能是因为凝胶/膜三明治的组装顺序反了，从而使蛋白质迁移到了缓冲液中。应按照使用手册中的说明，按正确顺序组装转印三明治。

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

注意：与中等至低分子量蛋白质相比，高分子量蛋白质通常不能完全转印。

以下是可能原因和解决方案：

• 转膜缓冲液的离子强度较高。应按照使用手册的说明来配制缓冲液。
• 电源运行时的电流接近电源电流极限。应使用具有更高极限的电源。

条带呈旋涡状和扩散状通常是因为分子在与膜结合前发生了横向移动。以下是可能原因和解决方案：

注意：未压缩海绵垫的高度应比密封垫片高0.5–1.0 cm。

以下是可能原因和解决方案：

• 凝胶与膜之间存在气泡，阻碍了蛋白质转印。应确保用玻璃吸管滚过膜表面，除去凝胶与膜之间的所有气泡。
• 使用了过期或有折痕的膜。应使用新的、无破损的膜。

对于大于100 kDa的蛋白质，我们建议在组装三明治前，将凝胶置于含有0.02-0.04% SDS的2XNuPAGE™转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含甲醇和0.01%SDS的1XNuPAGE™转膜缓冲液进行转印。

• 将Tris-甘氨酸转膜缓冲液的pH增加至9.2，可使pl低于9.2的所有蛋白质朝阳极方向迁移。
• 使用Tris-甘氨酸转膜缓冲液，并在凝胶两侧各放一张膜。碱性高于转膜缓冲液pH的蛋白质，将被凝胶阴极侧的膜捕获。随后，可以用相同的方式处理两张膜。
• 转印前，将凝胶置于含0.1% SDS的Tris-甘氨酸转膜缓冲液中孵育15分钟。少量的SDS会给予蛋白质足够的电荷，使蛋白质朝阳极端单向移动，并且在大部分情况下不会使蛋白质变性。然后，使用常规Tris-甘氨酸转膜缓冲液进行转印。

电流异常升高的最常见原因是转膜缓冲液。如果转膜缓冲液浓度太高，会导致电导率增加和电流升高。如果不小心用Tris-HCl代替了转膜缓冲液所需的Tris base，也会导致高电流。Tris-HCl可使缓冲液pH降低，引起电导率和电流升高，从而导致过热。我们建议检查转膜缓冲液及其试剂成分，然后重新稀释或重新配制缓冲液。

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

• 膜在组装到转印三明治中之前变干了。膜在放到三明治中时，应该完全是灰色或呈半透明。如果膜干了，应用甲醇润湿，然后在转膜缓冲液中预平衡。
• 不可用乙醇润湿膜。PVDF是疏水性的，需在转印前置于甲醇或乙醇中短暂浸泡。

以下是可能原因和解决方案：

• 膜未完全润湿。一定要按照生厂商的说明预先润湿膜。白点是膜的干燥区域。
• 电流过高。应使用具有低电导率的转膜缓冲液，例如使用手册中推荐的缓冲液。

这表明电路未闭合，以下是可能原因和解决方案：

这表示运行期间出现断路。如果在运行期间打开盖子，会出现这种情况。

盖上盖子，轻按一下开始/停止按钮继续运行，或长按开始/停止按钮重新开始运行。

这最可能是由顶部膜组的位置不正确引起的。应确保正确放置iBlot™阴极膜组（顶部），使铜电极一侧朝上。不要将顶部膜组反向放置。

转印时间过长可使铜离子沉积，导致颜色变蓝。应确保每种类型的凝胶都以其相应的推荐时间进行转印。

变为绿色是由于iBlot™转印膜组中的铜离子被液体带走并沉积到膜上。这些沉积物不会影响下游过程。可将染色区域剪掉，但是，对膜进行清洗通常也可除去沉积物。为了将这种作用降至最低，应分别在将滤纸和凝胶放到转印膜组上之前，甩掉多余的水和缓冲液。

若将膜修剪成符合凝胶大小的尺寸，会导致iBlot™阴极膜组（顶部）与阳极膜组（底部）直接接触，从而发生熔化情况。必须保持膜的尺寸与转印膜组一致。与膜相比，较小的凝胶尺寸不会影响转印质量。

这可能是因为没有电流通过或者使用了错误的电压方法。应确保电路闭合，并且有电流通过设备。请确认使用了正确的电压方法（见使用手册第13页）。

以下是可能原因和解决方案：

• 凝胶与膜之间存在气泡，阻碍了蛋白质转印。应确保使用适用于E-PAGE™凝胶的De-bubbling Roller或适用于其他凝胶的Blotting Roller，赶走凝胶与膜之间的所有气泡。
• 使用了过期或有折痕的膜。应使用未超过包装有效期的iBlot™凝胶转印膜组。

如果使用了错误的电压方法或不适当的转印条件，可能会出现这种情况。应按照使用手册第13页的说明，使用与凝胶类型相符的正确电压方法和运行时间。

对于小量或中量[小型或中型]凝胶：

• 按照使用手册第28页的说明，采用乙醇预平衡步骤以改善转印。
• 使用较低比例的凝胶来分离高分子量蛋白质。
• 逐渐增加转印时间，每次增加30秒。

对于E-PAGE™凝胶：

• 逐渐增加转印时间，每次增加30秒。
• 使用方法P2，转印8分钟。

注意：有些蛋白质残留在凝胶中属于正常情况，因为，与半湿转装置相比，iBlot™凝胶转印设备对某些高分子量蛋白质的转印不完全。

如果转印时间过长，可能发生这种情况。我们建议逐渐缩短转印时间，每次减少30秒。

注意：预染标记物带有电荷，所以穿过膜的可能性比普通蛋白质更大。

这是因为上样孔周围的电场不均匀。应使用De-bubbling Roller将E-PAGE™凝胶上样孔周围的突出部分压平。为得到最佳转印结果，我们建议对E-PAGE™凝胶使用De-bubbling Roller。如果将Blotting Roller用于E-PAGE™凝胶，应遵循使用手册第22页的建议以获得良好的结果。

这可能是因为PVDF膜变干或部分变干。PVDF膜的干燥部分比湿润部分颜色更白。应将膜置于100%甲醇中再次活化，并用水清洗，然后再放到转印膜组上。

这可能是因为使用了TBST缓冲液进行洗涤。我们建议使用PBST或WesternBreeze™洗涤液。

这最可能是因为蛋白质上样量过多，使检测超出线性范围。由于使用iBlot™凝胶转印设备进行干转的免疫检测灵敏度高于半干转或湿转，我们建议您减少蛋白质上样量、使用更稀的抗体或缩短检测时间。您可能需要根据最初的结果进行一些优化。

PVDF膜可能在处理或运输中丢失。活化的PVDF膜是透明的，很难看到。如果在顶层膜组中没有PVDF膜，我们建议检查阳极膜组（透明托盘）的铝密封片，确认PVDF膜没有粘到密封片上。如果膜粘到了密封片上，我们建议用纯甲醇再次活化膜，并用蒸馏水清洗干净，然后小心放到膜组上。再活化过程不会影响性能。

iBlot™设备必须直接连接到进行固件升级的电脑。不要使用USB转换器。

为了进行环回测试，应首先确认已成功安装驱动和COM端口。

1. 在安装了USB串行驱动的情况下，将您的iBlot™设备连接到电脑的USB端口。
2. 进入Windows设备管理器（开始->控制面板->系统->硬件选项卡->设备管理器）的端口（COM & LTP）选项下，查看是否已成功创建USB串行端口（COM）。如果设备管理器的列表中无COM端口，则尚未成功创建。您可使用http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm手动安装驱动。
3. 如果有多台设备连接到同一个USB串行端口，您可能需要断开其他设备。

如果上述步骤无效，还有一个可能会解决问题的简单方法是换一根USB连接线。

这可能是因为USB连接线在升级过程中断开。请更换电脑和USB连接线再试一次。

这最有可能是因为转印期间电流分布不均匀，可能是电极太差。我们建议更换新的电极（货号IB1002）。

这表明电路未闭合，以下是可能原因和解决方案：

这可能是因为顶部膜组的位置不正确。应确保正确放置顶部膜组，使铜电极一侧朝上。不要将顶部膜组反向放置。

转印时间过长可导致铜离子沉积。应确保每种类型的凝胶都以其相应的推荐时间进行转印。

变为绿色是由于铜离子被液体带走并沉积到膜上。这些沉积物不会影响下游过程。可将染色区域剪掉，但是，对膜进行清洗通常也可除去沉积物。

若将膜修剪成符合凝胶大小的尺寸，会导致顶部和底部膜组直接接触，从而发生熔化情况。保持膜的尺寸与转印膜组一致，可避免这种情况的发生。与膜相比，较小的凝胶尺寸不会影响转印质量。

这可能是因为没有电流通过或者使用了错误的电压方法。应确保电路闭合，并且有电流通过设备。请确认使用了正确的电压方法（见使用手册第17页）。

以下是可能原因和解决方案：

• 凝胶与膜之间存在气泡，阻碍了蛋白质转印。应确保使用Blotting Roller赶走凝胶与膜之间的所有气泡。
• 使用了过期或有折痕的膜。应使用未超过包装有效期的iBlot™ 2凝胶转印膜组。

如果使用了错误的电压方法或不适当的转印条件，可能会出现这种情况。应按照使用手册第17页的说明，使用与凝胶类型相符的正确电压方法和运行时间。

对于小量或中量凝胶：

• 按照使用手册第35页的说明，采用乙醇预平衡步骤以改善转印。
• 使用较低比例的凝胶来分离高分子量蛋白质。
• 逐渐增加转印时间，每次增加30秒。

对于E-PAGE™凝胶：

• 逐渐增加转印时间，每次增加30秒。
• 使用方法P2，转印8分钟。

注意：有些蛋白质残留在凝胶中属于正常情况，因为，与半湿转装置相比，iBlot™ 2凝胶转印设备对某些高分子量蛋白质的转印不完全。

如果转印时间过长，可能发生这种情况。我们建议逐渐缩短转印时间，每次减少30秒。

注意：预染标记物带有电荷，所以穿过膜的可能性比普通蛋白质更大。

这是因为上样孔周围的电场不均匀。应使用Blotting Roller将凝胶压平。为得到良好的效果，请遵循使用手册第19页的建议。

这可能是因为PVDF膜变干或部分变干。PVDF膜的干燥部分比湿润部分颜色更白。应将膜置于100%甲醇中再次活化，并用水清洗，然后再放到转印膜组上。

这可能是因为使用了TBST缓冲液进行洗涤。我们建议使用PBST或WesternBreeze™洗涤液。

这最可能是因为蛋白质上样量过多，使检测超出线性范围。由于使用iBlot™ 2凝胶转印设备进行干转的免疫检测灵敏度高于半干转或湿转，我们建议您减少蛋白质上样量、使用更稀的抗体或缩短检测时间。您可能需要根据最初的结果进行一些优化。

这可能是因为盐沉积在盒子内的活动部件。用温水润洗盒子的顶端和低端，同时戴上手套除去所有粘稠的残留盐。用去离子水简单冲洗，然后放在架子上干燥。

为了更彻底清洗，可将未组装的盒子浸泡在温水中，用戴着手套的手或干净的海绵除去所有粘稠的残留盐。用去离子水冲洗，然后垂直放在架子上干燥。

注意：盒子顶部（阴极）和底部（阳极）未保持清洁，会导致活动部件粘稠和转印效率降低。

以下是可能原因和解决方案：

PVDF膜需要更为严格的封闭步骤。这可通过将封闭剂的浓度增加2-5倍、延长封闭时间并在37℃封闭来实现。封闭剂与无蛋白质结合的位置结合，可防止背景染色，并封闭与膜结合的蛋白质，以减少其与一抗发生非特异性相互作用。封闭剂可使用脱脂奶粉、BSA和酪蛋白。

最可能导致旋涡状图案的原因是膜在染色液中绕圈移动。使用定轨摇床会产生这种效果。为了避免出现这种背景图案，我们建议使用摇臂式摇床或结合摇臂和往复动作的摇床，以确保膜在染色液中均匀晃动。