用于哺乳动物细胞表达的腺病毒基因转入技术 - 入门

腺病毒表达通常适用于瞬转，而慢病毒表达一般适用于长时程表达。腺病毒载体可在293A细胞中扩增数次，慢病毒的浓缩可采用离心方法。腺病毒需要宿主细胞表达CAR受体才能实现有效的转导，由于慢病毒颗粒上包被了VSVG膜蛋白，这些病毒能够适用于更广泛的哺乳动物细胞类型。

MOI（multiplicity of infection）描述的是感染复数。从理论上讲，MOI=1意味着平板中生长的每一个细胞被一个病毒颗粒所感染，MOI=10意味着每个细胞被10个病毒颗粒所感染。不过，许多因素都会影响最优的MOI，如哺乳动物细胞系的天然属性，（分裂与不分裂细胞），转导效率，目的用途以及感兴趣的蛋白等。

当您第一次将构建的腺病毒或慢病毒转导进所选的哺乳动物细胞系中时，我们建议您尝试使用一个MOI范围（0,0.5,1,2,5,10,50），以确定获得最佳基因表达效果所需的MOI值（使用慢病毒转导神经元时，我们一般使用超过50的MOI值——如MOI 100）。当您确定了获得最佳基因表达效果所需的MOI值后，后续的转导实验就都可应用这一优化的MOI值。

如果您希望实现病毒的稳定整合和进行筛选，请选择慢病毒系统。我们同时销售定向的TOPO（D-TOPO）和Gateway两种试剂盒，希望能够为用户提供目的基因克隆操作的灵活性。如果您在寻找瞬时基因表达系统，请选择腺病毒。我们提供Gateway克隆法试剂盒。

不过用户还是需要注意，这两种系统中的基因表达水平通常需在转导24-48小时后进行检测，所以其实两种系统均能实现瞬时表达操作。两者之间的主要区别在于慢病毒会整合到宿主基因组中，而腺病毒不会。腺病毒能够获得更高的病毒滴度。

我们的ViraPower™腺病毒表达载体的骨架源自5型人类腺病毒（Ad5）。

不，我们的系统使用的是5型人类腺病毒（Ad5）。

pAd-DEST质粒很大（>34 kb），过多的操作有可能造成DNA的断裂，进而导致LR的重组效率降低。操作pAd-DEST质粒时，请勿剧烈涡旋或吹打质粒溶液。这些载体是以超螺旋的形式提供的，冻干处理和室温保存都可能造成质粒受损。只要能够有效避免DNA的断裂，冻融操作是可行的。

我们推荐用户在–20°C条件下储存腺病毒表达载体。由于它们相对较大，我们并不推荐在–80°C保存这些载体，因为在–80°C条件下，载体溶液将彻底冻结，–80°C条件下的过多反复冻融将会影响克隆效率。

一旦您构建了pAd/CMV/V5-DEST™或pAd/PL-DEST™表达克隆，您就可以使用任意方法来制备纯化的质粒DNA了。我们推荐用户使用PureLink HiPure质粒中抽试剂盒（Plasmid Midiprep Kit，货号K210004）或CsCl密度梯度离心法来分离质粒DNA。

注意：我们推荐用户在制备质粒后通过一个限制性酶切分析来验证表达载体的完整性。

在将表达克隆转染进293A细胞之前，您须暴露载体上左侧和右侧的病毒反向末端重复序列（LTRs），以辅助病毒复制和包装过程的顺利进行。同时，这一操作也将去除细菌序列（即pUC来源和氨苄青霉素抗性基因）。pAd/CMV/V5-DEST™和pAd/PL-DEST™载体均包含Pac I限制性酶切位点（请分别参见使用手册第20页和第22页图谱中的Pac I位点）。

注意：请确保你的目的DNA序列中不含任何Pac I限制性酶切位点。如果您无法应用Pac I位点进行处理，您也可换用Swa I位点。

您可在表达细胞系（或293A细胞）中转染您的腺病毒构建序列，来观察蛋白是否能够成功表达，而无需等待两周（病毒包装时间）。由于质粒较大，转染效率会较低，所以用户可能需要遵循ViraPower™腺病毒表达系统手册中的说明，来向培养基中加入更多的脂质体-DNA复合物。这一操作过程中请勿使用Pac I消化腺病毒质粒，因为超螺旋质粒的转染效率更高。如需在293A细胞中检测蛋白表达情况，请在转染后2-3天收获细胞。  

我们使用经测试不含支原体的Gibco FBS（货号16000-044），并用下列塑料器皿进行293A细胞的培养： 

T175—Fisher 货号 10-126-13；这是一款Falcon培养瓶，带有0.2 μm透气孔的密封盖。 

T75—Fisher 货号 07-200-68；这是一款Costar培养瓶，带有0.2 μm透气孔的密封盖。 

100 mm 平板—Fisher 货号 08-772E；这是一款针对组织培养应用进行预先处理的的Falcon聚苯乙烯平板。

我们在日常的细胞培养/维持过程（除在293A细胞中生成腺病毒时的细胞裂解过程）中使用这些平板获得了绝佳的贴壁效果。

任何293来源的细胞系及其他表达E1蛋白的细胞系均适用于腺病毒的生产。293A中A代表“贴壁”，是因为293A细胞（只是常规293细胞的一个单细胞克隆）具有贴壁的倾向，在组织培养皿中会形成平铺生长良好的单层细胞。这就是为什么这些细胞很适合应用于噬斑测定实验。普通的293细胞不会形成这样的单层细胞；它们生长所形成的细胞层会出现孔洞和空白之处。

大多数腺病毒包含在漂浮的细胞中，细胞破裂之前它们并不会释放到培养基中。我们推荐每三天左右更换一次培养基，直至大量细胞变大变圆，并从塑料培养皿上脱离下来。一旦细胞发生破裂，游离的病毒就会迅速感染邻近的细胞。如果您很担心在更换培养基的过程中损失这些受到感染的细胞（及内在的病毒），您可保留含有漂浮细胞的培养基，冻/融三次后将其中的一小部分（可能1/10左右）与新鲜培养基一道重新加回新鲜培养基中。或者，您也可使用新鲜培养基，以显著高于每三天一次的频率进行半换液。

我们推荐您立即将所生成的腺病毒母液分装为小的工作体积，之后在–80°C条件下长期保存。由于腺病毒不具有外包膜，因此病毒母液的相对稳定性较好，可耐受一定量的冻融操作。我们不推荐对病毒母液冻融超过10次，这可能会造成病毒滴度的损失。如经良好保存，拥有适当滴度的病毒母液可持续使用一年以上。经长期保存后，我们推荐您在使用前重新测定病毒滴度。

一旦您获得了病毒母液，您就可应用这一母液感染一批新的293A细胞来生产更高滴度的病毒（扩增病毒）。用于转染293A细胞的原始病毒母液滴度通常在1 x 10⁷至1 x 10⁸噬菌斑形成单位（pfu）/mL。扩增操作能够生成范围在1 x 10⁸至1 x 10⁹ pfu/mL滴度的病毒，我们通常推荐用户进行这一操作。请参见使用手册第19页对于病毒扩增操作的说明。

注意：其他293细胞系以及表达E1蛋白的细胞系均适用于病毒扩增操作。

腺病毒可通过多种方法（如CsCl纯化；请参考手册第25页的参考文献）浓缩至1 x 10¹¹ pfu/mL的滴度。

未扩增的腺病毒的滴度通常在1 x 10⁷–1 x 10⁸噬菌斑形成单位（pfu）/mL。您可使用这一母液感染一批新的293A细胞来生产更高滴度的病毒液（即扩增病毒）。扩增操作能够生成范围在1 x 10⁸至-1 x 10⁹ pfu/mL滴度的病毒液。腺病毒可通过多种方法（如CsCl纯化）浓缩至1 x 10¹¹ pfu/mL的滴度。

我们的ViraPower™腺病毒表达载体的骨架源自5型人类腺病毒（Ad5）。Ad5能够与柯萨奇病毒与腺病毒受体相结合，进而通过整联蛋白介导的内吞途径进入细胞。使用充分表达CAR受体并活跃分裂的靶细胞，以及足量的MOI值，就可能达到80-90%的腺病毒转导效率。

注意：不同类型细胞的转导效率会有所不同。举例：在HT1080细胞中，以MOI=1进行转导，转导效率可达90%左右。在某些种类的细胞中，您可能需要使用10倍以上MOI才能获得同等转导效率。

人类5型腺病毒（Ad5）能够与柯萨奇病毒与腺病毒受体相结合，进而通过整联蛋白介导的内吞途径进入靶细胞。由于CAR/整联蛋白广泛分布于哺乳动物细胞中，因此腺病毒能够转导非常广谱的细胞类型。如果您特异性的细胞类型表达CAR的水平极低，腺病毒的转导效率就会下降，这时您可能需要使用非常高的MOI（MOI=100）值才能获得良好的表达效果。 

pAd/CMV/V5-DEST™或pAd/PL-DEST™腺病毒载体不会整合到宿主基因组。一旦转导进入目的哺乳动物细胞中，您的重组蛋白就会伴随病毒基因组的存在一直持续表达。对于分裂活跃的细胞而言，转基因表达会随着时间流逝而逐渐降低，转导2周后降至背景水平。在不分裂的CD34+细胞或动物组织等（骨骼肌、神经元、肝脏）中，转基因表达效果非常稳定，可在转导后持续6个月之久。 

在分裂活跃的细胞（每24小时倍增一次）中，我们发现通常可在转导24小时后观察到转基因表达，转导48-96小时（2-4天）时观察到最大量蛋白表达。表达水平通常在转导5天后开始下降。在倍增时间更长或非分裂型的细胞中，高水平的转基因表达会持续更长时间。

获得细胞转染和观察到丰富的病毒转导效果是两件不同的事情。如果您的培养物中只有一两个细胞在产生病毒，就可能需要等很长时间才能通过肉眼观察到（比人们一般可接受的等待时间更长）。转染效率与病毒得率有关，因为你转染的细胞越多，在第一周或第二周观察到病毒生成的机会就越高。如果您的转染效率较低，尽管您最终还是会看到病毒生成效果，但等待的时间就会更长。

ViraPower™腺病毒表达系统有以下特性，提升了其生物安全性：

• 腺病毒表达载体（pAd/CMV/V5-DEST™和pAd/PLDEST™）中删除了整条E1基因，由293A生产细胞系来提供（这一基因）。由于E1的表达（E1a与E1b）对于其他腺病毒基因（如晚期基因）的表达是必需的，因此在任何不表达E1a和E1b的哺乳动物细胞中使用这一系统生产的腺病毒都不具备复制能力。
• E3基因在体外应用中可完全省略，因此也被从腺病毒表达载体骨架中删去。
• 在转导过程中腺病毒不会整合进宿主基因组中。由于该病毒是复制缺陷型的，因此病毒基因组的存在是瞬时的，而且最终会随着细胞分裂而逐渐被稀释。

尽管有以上安全特性方面的设计，所生成的腺病毒仍具有某些生物安全方面的风险，因为它们仍具有转导人体原代细胞的能力。基于此种原因，我们强烈建议您按照二级生物安全（BL-2）标准来操作本系统生成的腺病毒母液，并严格遵守全部已发表的BL-2准则。此外，当创建的腺病毒中携带有潜在毒性或有害基因（如激活型致癌基因）时，或大规模制备病毒时，需格外小心（参见使用手册第10页。

如需了解更多关于BL-2准则以及腺病毒操作的详细信息，请参见由疾病控制中心（CDC）出版的文件《微生物学与生物医学实验室的生物安全（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories）》第四版（www.cdc.gov/biosafety/publications/index.h™）。