用于哺乳动物表达的腺病毒基因转入支持 – 问题排查

实验遇到问题了吗？

我们致力于确保您的成功，让您重回正轨。敬请浏览我们就常见的问题提供的专业建议。

浏览下列相关问题答疑：

您正准备开始实验？
敬请浏览我们的

腺病毒表达

以下为一些可能的原因与解决方案：

原因	解决方案
使用不正确的抗生素来筛选转化子	在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上筛选转化子。
未使用蛋白酶K处理LR重组反应体系	在转化前使用蛋白酶K处理LR重组反应体系。
在LR反应中使用了过多的入门克隆DNA	在LR反应中使用50-150 ng入门克隆DNA。
在LR反应中使用不当的入门克隆:DEST载体比例	入门克隆:DEST载体的摩尔比应为1:1。
对插入片段长于5 kb的LR重组反应体系只孵育1小时	对插入片段长度超过5 kb的片段，我们建议将LR反应体系孵育过夜。注意：过夜孵育也能提升小插入片段的克隆数目。
腺病毒Destination载体DNA发生了断裂	务必小心操作腺病毒Destination载体。不要进行过多可能造成DNA断裂的操作（如涡旋或剧烈吸打溶液）。
没有用推荐数量的LR Clonase II酶混合物，或LR Clonase II酶混合物已失活	-请确保将LR Clonase II酶混合物保存于–20°C。 -请勿将LR Clonase II酶混合物冻融超过10次。 -请使用推荐用量的LR Clonase II酶混合物（参见使用手册第14页）。 -请尝试另一管分装的LR Clonase II酶混合物产品。
转化时使用的LR反应体系不足	使用适当的大肠杆菌感受态菌株来转化2-3 μL LR反应体系。使用转化效率 >1 x 108 cfu/μg的大肠杆菌细胞。
使用不足量的转化混合物进行铺板	增加大肠杆菌的铺板用量。

以下为一些可能的原因与解决方案：

原因	解决方案
将LR反应体系转化至包含F'游离体和ccdA基因的大肠杆菌菌株中	使用不含F'游离体的大肠杆菌菌株进行转化（如TOP10、DH5α-T1R）。
（完全或部分）删除腺病毒Destination载体中的ccdB基因	腺病毒Destination载体以溶液形式提供，可直接应用于LR反应。不过，如果您希望扩增这些载体，我们推荐您使用One Shot ccdB Survival™ 2 T1R化学感受态细胞（货号A10460）。 -在含有50–100 μg/mL氨苄青霉素和15–30 μg/mL氯霉素的培养基中筛选转化子，以维持载体的完整性。 -从一个或多个克隆制备质粒DNA，并在使用前验证载体的完整性。

以下为一些可能的原因与解决方案：

原因	解决方案
低转染效率： -腺病毒Destination载体发生了断裂 -不彻底的Pac I消化效果或消化后的DNA含有苯酚、乙醇或盐类 -使用了不健康的293A细胞；细胞活力较低 -293A在转染前一天培养密度过低 -质粒DNA与转染试剂之间的比例错误	-小心操作腺病毒Destination载体。不要进行过多可能造成DNA断裂的操作（如涡旋或剧烈吸打溶液）。 -重新进行Pac I消化处理。请确保使用未含苯酚，乙醇或盐类的纯净DNA。 -使用健康的293A细胞；不要让细胞过度生长。 -转染时刻细胞（密度）应处于90-95%的融汇度。 -将质粒DNA（μg为单位）:Lipofectamine 2000（μL为单位）的比例设置为1:2到1:3。如果您正在使用另一款转染试剂，请按照生产商的推荐用法进行条件优化。
病毒上清液稀释过度	通过CsCl离心或任意可选方法对病毒进行浓缩处理。
病毒上清液经多次冻融	请勿将病毒上清液冻融超过10次。
目的基因过长	病毒滴度通常随着插入片段长度的增加而降低；不推荐使用超过6 kb（在pAd/CMV/V5-DEST™中）和7.5 kb（在pAd/PL-DEST™中）的插入片段。
目的基因对细胞有毒性	不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。

以下为一些可能的原因与解决方案：

原因	解决方案
病毒母液未正确储存。	分装并将母液保存于–80°C。请勿将其冻融超过10次。
使用错误的细胞系进行病毒滴度测定	请按照手册第23页中所讨论的属性选择细胞系，或直接使用293A细胞系。
未正确制备琼脂糖覆层	请确保向细胞加入的琼脂糖不会过热；过热的琼脂糖将杀死细胞。
病毒储存液的滴度过低或过高	以更宽广的续列稀释度（以10倍为单位，如10^-2至10^-8）来测定腺病毒的滴度。

这可能由病毒上清液的稀释度不足所致。我们推荐您使用从10^-4至10^-9续列稀释度来检测腺病毒滴度。

以下为一些可能的原因与解决方案：

以下为一些可能的原因与解决方案：

原因	解决方案
低转导效率： -哺乳动物细胞不够健康 -使用了非分裂型细胞	-请确保您用的细胞在转导前保持健康状态。 -以更高的MOI比例值向您的细胞中转导腺病毒。
MOI值过低	以更高的MOI比例向您用的细胞中转导腺病毒。
病毒滴度过低	使用手册第20页的步骤扩增腺病毒母液。
腺病毒母液受RCA（具有复制能力的腺病毒）污染	-筛查RCA污染。 -制备全新的腺病毒母液或噬菌斑纯化以分离重组的腺病毒。
转导操作后过早收获细胞	请至少在转导24小时之后收获细胞。
转导操作后过晚收获细胞	对于分裂活跃的细胞，请在转导5天内检测重组蛋白表达的最高水平。
目的基因对细胞有毒性	不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。

以下为一些可能的原因与解决方案：

原因	解决方案
使用了过量的原始病毒母液	-减少用于转导的原始病毒母液，或对原病毒母液进行稀释。 -Amplify the adenoviral stock. -Concentrate the crude viral stock.
野生型RCA（具有复制能力的腺病毒）污染	筛查RCA污染。噬菌斑纯化以分离重组的腺病毒，或制备全新的腺病毒母液。
目的基因对细胞有毒性	不推荐构建包含激活型致癌基因或潜在有害基因的载体。

仅限研究用途，不可用于诊断操作。