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当您的目的基因具有毒性时这种情况很常见。尝试使用更严格调控的系统,如BL21 (DE3) (pLysS)或BL21 (DE3) (pLysE)或BL21(AI)。
使用新鲜的细菌培养物进行接种,因为新鲜的细菌菌落通常可得到较高的蛋白得率。
检查重组蛋白序列中的不常用密码子。利用常用密码子代替稀有密码子,可显著提高表达水平。例如,精氨酸密码子AGG和AGA是大肠杆菌的不常用的密码子,所以这些密码子的tRNA水平低。
进行蛋白纯化时,在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂,如PMSF。使用新鲜配制的PMSF,因为PMSF被稀释到水溶液中后30分钟内会失效。
如果您在表达实验中使用氨苄青霉素进行筛选,则可能会因为筛选条件缺失而出现质粒不稳定。这是因为氨苄青霉素被β-内酰胺酶破坏,或者在由细菌代谢物造成的酸性培养基条件下发生水解。在转化和表达实验中,可使用羧苄青霉素替代氨苄青霉素。
重组蛋白可能对细菌细胞具有毒性作用。应选择更严格调控的系统用于表达,如BL21-AI。也可考虑尝试使用不同的表达系统,如pBAD系统。
如果存在溶解性问题,可尝试在诱导时降低温度或减少IPTG用量。也可尝试使用不同的、更严格的菌株进行表达。此外,在表达期间,也可将细菌培养基的葡萄糖含量增加至1%。
通常,如果您看见1-2条主带,则表示密码子使用偏好导致了翻译过早终止。发生降解时,通常可看到梯度条带。发生降解时,可尝试在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂有助于防止降解。如果是这种情况,可通过时间点实验来确定收细胞的最佳时间。
有多种措施可防止由毒性基因本底水平表达带来的问题。这些方法均基于T7或Champion™表达质粒的设计和构建是正确的:
仅限研究用途,不可用于诊断操作。