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无细胞表达系统

我的蛋白得率很低或完全不表达，但我的对照组成功生成了蛋白。我该如何处理？

Please review the following suggestions:

  • 检查您的载体序列（ATG起始密码子，读码框的一致性，等等）。
  • 如果您的载体包含N端或C端标签，这些序列可能会影响RNA结构和降低翻译水平。可尝试去除融合标签或其他末端序列。
  • 请确保DNA模板的纯度，且不含酒精、钠盐、乙酸铵或RNA酶等污染物。
  • 不要使用琼脂糖凝胶中纯化出的DNA，它们会抑制表达反应。
  • 我们推荐您在2 mL的蛋白合成反应体系中使用10–15 µg的模板DNA。如果您表达的蛋白分子量较大，则可将蛋白合成反应中的DNA模板用量增至20 µg。
  • 请确保使用恒温混匀仪或带有振荡功能的孵箱来进行反应，请勿使用不带振荡功能的孵箱或水浴。
  • 多次补料有助于提升蛋白得率。在蛋白合成反应起始后，您可通过更频繁地以小体积多次向样本加入补料缓冲液（feed buffer），来代替在反应初始阶段的30分钟时间点进行一次性补料的操作（即在3小时的时间内，每隔45分钟就向1 mL样本总加入0.25 mL补料缓冲液）。
我的蛋白形成了聚集物。我该如何处理？

您可在蛋白合成阶段尝试降低孵育温度至25–30°C。此外，也可向反应体系和补料缓冲液中加入温和的去垢剂（如至多0.05%的Triton-X 100,0.025%的十二烷基麦芽苷钠，0.1% CHAPS或0.05% Brij-58）。您也可尝试向反应体系中加入分子伴侣。

我表达大分子量蛋白的得率很低。我应如何提升蛋白得率？

蛋白得率通常随着蛋白分子量的增加而减小。您可于蛋白合成阶段尝试降低孵育温度至25–30°C。

我的对照组反应不成功。我该如何处理？

如果您的对照组反应未生成蛋白，则可能是试剂丧失活性或受RNA酶的污染。请检查储存条件和试剂的保质期。请小心进行Expressway™大肠杆菌slyD-Extract，Expressway™ 2.5X IVPS大肠杆菌反应缓冲液和Expressway™ 2X IVPS补料缓冲液（Feed Buffer）的冻融操作。一或两次的冻/融循环是可行的，但应避免多次冻融循环。

我获得的蛋白得率不错，但其生物活性很低。我该如何处理？
  • 您的蛋白可能未正确折叠——请尝试在蛋白合成过程中将孵育温度降低至25°C。
  • 您可能需要对蛋白进行翻译后修饰———Expressway™系统不会为重组蛋白进行翻译后修饰。
  • 您所合成的蛋白可能需要辅助因子才能发挥全部活力——因此请尝试在合成反应中加入所需的辅助因子。
使用Expressway™系统反应后，在跑胶时我观察到小分子量产物形成了一条梯带。怎么会发生此种情况？

这种现象可能由多种原因所导致。最常见的原因包括：蛋白酶解，DNA和/或RNA模板的降解（截短型的模板将生成截短的蛋白产物），内部启始（如果基因内部含有多个甲硫氨酸和RBS类似序列，核糖体就有可能在错误的甲硫氨酸位点启始翻译过程），提前终止，翻译暂停，过于频繁地应用罕见密码子，复杂的二级RNA结构，等等。蛋白变性时间过长，或1X SDS-PAGE样品缓冲液中加入的SDS不足，也可能会发生这种现象。

我的凝胶中的样品出现弥散的情况。这可能是由什么原因所导致的？

样品弥散情况可能由以下原因所导致：

  • 未使用丙酮来沉淀样本——使用丙酮来沉淀蛋白将帮助去除背景弥散情况。
  • 蛋白上样量过多——减少蛋白样品的用量。
  • 凝胶自身不够干净——在胶片曝光之前对凝胶进行简单的润洗
  • 蛋白合成反应中包含乙醇——请确保在DNA纯化过程中去除了残留的乙醇。
  • 检查预制胶的保质期——请勿使用过期的凝胶产品。
我的T7 RNA聚合酶已用完。你们建议在后续使用什么产品？

我们推荐您使用T7 RNA聚合酶（货号18033019，50 U/µL）。请在50 µL反应系统中使用1–1.5 µL本产品。

我不小心将我的大肠杆菌slyD-Extract，大肠杆菌反应缓冲液（E. coli Reaction Buffer）（-A.A.）和补料缓冲液（feed buffer）保存在室温下。我还能继续使用它么？

很抱歉，这样的操作会导致产品失活。

膜蛋白

在使用MembraneMax™试剂盒的过程中，我获得的蛋白得率很低或完全不表达。这可能是由什么原因所导致的？

请参见以下建议：

  • 请检查您DNA模板的构建（ATG起始、标签、终止密码子、阅读框等等）。
  • 请确保DNA模板的纯度。
  • 请勿通过凝胶纯化法来抽提您的DNA，使用这样的DNA会抑制蛋白合成反应的进行。
  • 请确保使用正确的DNA模板用量；我们推荐您在2 mL蛋白合成反应中使用10–15 µg模板DNA。
  • 请使用恒温混匀仪或带有振荡功能的孵箱进行蛋白反应。
  • 请确保使用正确剂量的MembraneMax™试剂。
  • 尝试不同的“补料（feed）”时间表——例如在蛋白合成起始30分钟和1个小时的时候，向样本中加入1/2体积的补料缓冲液（即向50 µL样本中加入25 µL补料缓冲液）。
  • 如需表达较大的蛋白，请尝试在合成过程中将孵育温度降至25–30°C。
  • 蛋白可能发生降解；将孵育时间限制在2小时之内，并在反应步过程减少操作步骤。
我能将我的MembraneMax™反应孵育的时间延长至2小时以上么？

是的，您可将孵育时间延长至4小时以尝试增加蛋白得率，不过这一操作也可能导致形成多分散的胶团结构。由于两小时的孵育时间通常就能在多种蛋白上获得75%以上的表达效率，因此通常并不必要使用更长的孵育时间。您可尝试通过提升孵育温度来增加翻译速度，或通过降低温度来为蛋白正确折叠提供更长的时间。注意，请勿将温度降低至24°C以下，这是MembraneMax™试剂中DMPC脂质双分子层的转变温度。对补料时间表进行调整可能有助于提升您的合成反应效率。举例来说，您可尝试以50%的反应体积来起始反应，之后以30分钟的间隔两次加入25%反应体积的补料缓冲液。最后，您可按比例增加反应体系，以获得更大量的膜蛋白，因为蛋白得率通常是反应/体积依赖的。

我的蛋白成功实现了表达，但比色对照分析实验未显示出粉色结果。这是发生了什么情况？

全反式视黄醛可能被漂白；请确保所有的全反式视黄醛都保存在暗处，因为该物质的光稳定性不佳。

尽管我能通过MembraneMax™试剂盒获得蛋白，但蛋白自身的生物活性很低。这可能是由什么原因所导致的？

不正确的蛋白折叠会导致低蛋白活性。请尝试在蛋白合成阶段将孵育温度降至25°C。此外，您蛋白的翻译后修饰可能是蛋白表达活性所必须的。Expressway™ 大肠杆菌slyD-Extract并不会引入这些修饰（如糖基化或磷酸化）。最后，合成蛋白可能需要辅助因子的参与才能表现出全部活性。请确保在蛋白合成反应中加入了所需的辅助因子。

我在SDS-PAGE凝胶的30 kDa附近观察到了条带。那可能是些什么物质？

源自MembraneMax™试剂的支架蛋白在SDS-PAGE凝胶中呈现为28 kDa左右的条带。

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