蛋白表达基础支持 - 入门

表达载体通常包含以下元件：

• 目的基因表达阅读框（包括启动子-基因-终止子或poly（A）信号）
• 适用于特定宿主的抗生素筛选阅读框
• 适用于大肠杆菌的抗生素筛选阅读框
• 细菌复制起点

附加元件包括：

• 克隆位点
• 表位标签
• 分泌信号（N端）

请浏览下表来了解常用的组成型和诱导型启动子。

不能；尽管可生成转录本，但是没有翻译启始所需的核糖体结合位点（RBS）或Shine-Dalgarno序列。因此，大肠杆菌中将会转录mRNA，但不会翻译为蛋白。

核糖体结合位点（RBS）是mRNA分子5'（上游）的区段，能够结合核糖体正确定位至翻译启始位点。RBS能够控制mRNA翻译启始的准确度和效率。

在原核mRNA中，RBS位于起始密码子（即第一个AUG）上游7个核苷酸处。本序列也称为Shine-Dalgarno序列，是由位于AUG起始密码子5'端的多鸟苷酸序列AGGAGG所组成的。由于这一序列能够与30S核糖体亚基中16S rRNA的3'端实现互补，因此该信使RNA能够与核糖体高效结合。Shine-Dalgarno序列是必需的。

真核生物中的蛋白合成过程与这一模型不同。mRNA的5'端具有一个经修饰的化学结构（“帽”结构），能够被核糖体所识别，后者随之与mRNA相结合并沿着mRNA移动（“扫描”）直至找到第一个AUG密码子。碱基的特征模式（称为“Kozak序列”）有时在该密码子的周围被发现，以使人想起Shine-Dalgarno序列的方式帮助正确定位mRNA，但不与核糖体RNA形成碱基配对。因此，Kozak序列并非是核糖体结合位点，而是一个翻译启始增强子。保守的Kozak序列为G/ANNAUGG，其中的AUG表示起始密码子。-3位点的一个嘌呤（A/G）碱基具有显性效应；如果-3位点是一个嘧啶（C/T）碱基，则翻译进程会对-1，-2和+4位点的改变更为敏感。当-3位点从嘌呤变为嘧啶时，表达水平可能降低达95%以上。+4位点对于表达水平的影响较低，只发现有50%左右的降低影响。注意：酵母不遵循这一规则。果蝇中优化的Kozak序列会有些许的不同（C/AAAA/CAUG）。

ATG通常对于高效的翻译启始是足够的，尽管翻译效率要视目的基因而定。最佳的建议应是保持cDNA中天然起始位点，除非确定这一位点的功能性不理想。如果从表达的角度来考虑，推荐构建并测试两种载体，一个具有天然的起始位点，另一个具有保守的Kozak序列。通常情况下，所有N-端融合型表达载体都已包含了一个RBS或翻译起始位点。

IRES的全称为内部核糖体进入位点，能够介导不依赖末端的翻译启始过程。如果想在同一个启动子下，表达两个乃至更多基因，科研人员通常会在它们间加入IRES位点。

转录过程的终止是目的基因序列后的终止序列所介导的。以下列举了一些转录终止子的例子：

大肠杆菌：T7终止子

酵母：AOX与CYC1终止子

昆虫：SV40终止子

哺乳动物：SV40与BGH

病毒：3'LTR

通常情况下，引入表位标签是为了与您的目的基因进行融合，来使目的基因更易检测或快速纯化。表位标签可融合于目的基因的N-端或C-端。使用表位标签时有一些需要考虑的事项：

1. N-端标签可能含有蛋白酶切割位点
2. N-端标签中含有RBS/Kozak序列
3. 分泌信号肽一般位于N-端，并能够在高尔基体加工过程中自动被切割
4. 如果目的基因中含有天然分泌信号，则需将其替换
5. 当蛋白的C-端对于其功能至关重要时，请选用N-端标签
6. 当使用N-端标签时，请确保目的基因的末端含有终止密码子
7. 如果使用N-端标签，请确保目的基因与标签处于同一阅读框中
8. 当N-端对于蛋白功能至关重要时，或蛋白功能域未经鉴定时，请选择使用C-端标签
9. 在与C-端标签融合时，请确保去除了目的蛋白的终止密码子；终止密码子应位于C-端标签末端
10. 在使用C-端标签时，请确保在目的基因的起始部位包含起始密码子（ATG）和RBS/Kozak序列（如果需要的话）
11. 如需引入一个C-端标签，请确保该标签与目的基因处于同一阅读框中

这里有一些用于帮助您选择表位标签的基础指南：

我们所提供A、B和C型载体之间的差异在于载体多克隆位点（MCS）中增加或删除了单个碱基对。这些单个碱基的改变在每种类型的载体上形成了三种不同的阅读框。这些特性将帮助用户通过特定的限制性内切酶，插入目的基因使其与C-端标签在同一阅读框中。三种阅读框A、B和C的载体将以三个独立的试剂管形式提供。

请参考下表，以了解每种系统的不同特性：