用于蛋白高产量生产的哺乳动物细胞表达支持 - 入门

我们为蛋白的稳定高产量生产提供Freedom CHO-S与Freedom DG44试剂盒。我们为瞬时高产量生产提供ExpiCHO表达系统，Expi293™表达系统，FreeStyle™ 293 表达系统，FreeStyle™ Max 293表达系统和FreeStyle™ Max CHO表达系统。如需在Exp293F™细胞中高效表达功能性膜蛋白，我们还提供了Expi293™ MembranePro™ 表达系统（货号A25869，A25870），这款产品将Expi293™的扩展性/易用性与MembranePro™技术整合起来，能够将膜蛋白的表达产量大大提升，超出标准贴壁培养的MembranePro™功能性蛋白表达系统的表达产量20倍以上。请参见 应用说明 以了解更多详情。

除了Opti-MEM I低血清培养基为无血清但不是非动物源性的外，本系统中的其余成份均为非动物源性的，请参考应用说明，在非动物源性的条件下使用Expi293™表达系统。

我们推荐使用pcDNA™ 3.4-TOPO TA载体（货号A14697）。这一载体含有天然的全长CMV启动子和克隆位点下游的WPRE（旱獭转录后调控元件），这两个元件均有利于基因的高水平表达（表达比pcDNA™3.3 TOPO载体高大约2-3倍，而后者又比标准的pcDNA载体高2-5倍）。当然，实际表达水平还要视具体蛋白而定。 

pcDNA™ 3.4-TOPO TA载体在pcDNA™ 3.3-TOPO TA载体上进行了一个重要改进。它包含了能够使蛋白水平相比pcDNA™ 3.3-TOPO TA载体提升2-3倍的WPRE元件（旱獭转录后调控元件）。

大多数293细胞系均能适应从传统含血清或其它无血清培养基向Expi293™表达培养基中的切换按照手册中所描述的直接切换法或序贯切换法来操作，大多数293细胞系均能适应从传统含血清或其它无血清培养基向Expi293™表达培养基中的切换。

注意：切换后的细胞可能无法达到与Expi293F™细胞同等的高水平表达。

ExpiFectamine™ 293转染增强剂1和2是经过优化的专利混合试剂，该产品专为与ExpiFectamine™ 293试剂的配合使用而设计，能够提升蛋白表达水平从而提高瞬时表达的蛋白产量。须在适当时间（转染后第20小时）加入该产品，才能获得最高的蛋白产量。过早或过晚加入增强剂都将无法获得最高的蛋白产量。如果您忘记在推荐的时间窗内添加增强剂，我们建议您尽快将其加入。从实验方案中省略增强剂的加入步骤，将导致蛋白产量降低多达3倍的幅度。两种增强剂应搭配使用以辅助用户获得最高表达效率。相比添加两种增强剂的情况，只加入一种增强剂将导致表达水平的下降，蛋白表达水平可能会下降1/3至2/3。

我们不推荐用户使用OptiPRO™ SFM来配制DNA–ExpiFectamine™ 293转染复合物。如果您需要一款不含动物源性成份的表达系统，您可使用FreeStyle™ 293表达培养基来制备转染复合物，但请注意这一操作会导致最终的蛋白得率下降10-20%。

ExpiFectamine™ 293转染增强剂1和2专为与ExpiFectamine™ 293试剂的联合使用而设计，与其他转染试剂兼容性不佳。

Expi293™表达培养基并不直接兼容ProBond™或Ni-NTA纯化系统。我们推荐在用His标签的纯化操作之前进行一次缓冲体系交换或样本透析。

Expi293F™细胞必须按照使用手册中的实验步骤从冻存状态进行复苏并至少传代3次，以确保获得最佳的使用效果。如果按照手册中的实验方案进行培养，这些细胞能够至少在30次传代内保持性能。 

尽管Expi293™培养基能够支持更高的细胞密度，但我们并不推荐以超出5–6 x 10⁶个细胞/毫升的密度来培养Expi293™细胞，因为这会降低后续的转染和蛋白表达效率。在更高的细胞密度时，遇到培养活力降低临界点的可能性也会增加。如果您培养的细胞超出5–6 x 10⁶个细胞/毫升，请按照手册中的描述传代一至两次，监控它们的活力和生长速率。使用蛋白表达对照IgG或得率已知的表达载体来测试转染效果，从而确定细胞表达性能是否受到影响。

最佳的表达时间随不同的目的蛋白而发生变化，但大多数测试蛋白的最佳表达时间窗为3-7天。由于本系统具有良好的扩展性，我们推荐您可在放大扩种之前进行一个小规模测试实验，来决定何时收获目的蛋白。

Expi293F™细胞的生长和表达属性决定了在转染7天之后，培养基将临近耗竭，并应该已经达到最高蛋白表达量。继续孵育将导致培养细胞活力的显著下降。

新制备的转染复合物所获得的转染效率最佳。不过，这些复合物可在至少一小时之内保持稳定。 

不需要。Expi293™表达系统经设计省略了培养基的换液操作。因此无需在转染操作后去除转染复合物或更换培养基。

这要视所使用的培养瓶类型而定，不过常规经验是使用培养瓶的1/4体积。

在使用手册中，我们为不同型号的培养瓶提供了最佳的振荡速度。对绝大多数培养瓶而言，使用过快或过慢的振荡速度会引起细胞剪切力过大或者通气不足，从而导致表达水平的显著下降。这一负面效应在培养板中表现得更突出，因为在孔板中静态与动态液流之间的转变更剧烈。 

对于1L的培养体积，我们内部的科学家使用3L带挡板的培养瓶在转速80-85 rpm进行过培养；其使用的摇床为Innova 0.75英寸轨道摇床。

我们推荐用户单独将抗体的重链和轻链亚基克隆至pcDNA™3.4 TOPO载体中，之后再优化两种质粒的转染比例。每一种抗体均需要调整重链:轻链的使用比例，以获得最佳的抗体表达效果。将两条链克隆在各自的载体上使这一调整变得更容易。使用相同的载体可确保一开始每一亚基的表达处于同一水平。 

请参考应用说明获取在Expi293™表达系统中优化蛋白产量的相关提示。

可以，请参见Expi293™表达系统96孔微量滴定板的应用说明。简而言之，您可在2 毫升反应孔模块中使用700 微升的培养体系，并在3 毫米throw的涡旋振荡器（如Eppendorf MixMate混合器）上以1250-1500 rpm的转速进行振荡培养。

请参见应用说明中将Expi293™表达系统适应于WAVE Bioreactor™系统的操作方法。

除转染试剂和用于配制转染复合物的培养基不同之外，这两个系统拥有相同的组分。FreeStyle™ Max 293表达系统包含了FreeStyle™ Max试剂和OptiPRO™ SFM（非动物源性的无血清培养基），而FreeStyle™ 293表达系统则包含293fectin™转染试剂和Opti-MEM I减血清培养基（无血清培养基，但不是非动物源性）。

您可使用ExpiFectamine™293试剂来转染FreeStyle™ 293表达培养基中培养的FreeStyle™ 293-F细胞；不过，增强剂只会对蛋白表达提供少许的促进作用，因为这一产品是针对更高密度培养设计的，而FreeStyle™ 293表达培养基并不适用。 

FreeStyle™ Max试剂与293fectin™转染试剂能够提供水平相近的高转染效率；不过，FreeStyle™ Max试剂具有更低的细胞毒性，进而能够实现更高的蛋白得率。此外，FreeStyle™ Max试剂为非动物源性的。  

当比较FreeStyle™ 293-F细胞与FreeStyle™ CHO-S细胞的平均抗体和蛋白得率时，绝对是FreeStyle™ 293-F细胞在瞬转条件下的抗体得率会比FreeStyle™ CHO-S细胞高。而另一方面，稳转CHO细胞的抗体得率会更高。对于非抗体蛋白而言，我们无法预测这两株细胞系的得率哪个更高。

其他的293细胞系也可能适用于FreeStyle™ 293表达系统。不过，它们需要先适应到FreeStyle™ 293表达培养基的无血清悬浮培养条件中，并需评估转染和表达效率。

在使用FreeStyle™ 293表达培养基时，我们推荐稍早一些收获细胞，以减少宿主细胞蛋白所造成的非特异性结合，之后对培养上清液进行0.2 或0.1 µM的膜过滤，再上样至镍柱。另一方面，FreeStyle™ CHO表达培养基中含有的EDTA将会对镍柱起到洗脱的作用。因此在上样之前，应对这一培养基进行透析或缓冲体系交换，也可通过向上清液加入1-3 mg/L NiSO4或NiCl来螯合EDTA。另外可使用铁盐或钴盐。

有的。请访问 ExpiCHO 产品网页 thermofisher.com/expicho，上面有一段简短视频，准确地介绍了我们如何在实验室中使用 ExpiCHO 系统进行表达。这是帮助您上手使用或者解决疑难问题的绝佳资源。

收到使用干冰运输的细胞后，最好立即将细胞解冻，或者将冻存管放入液氮中储存约 72 小时，使细胞适应环境，然后再解冻；不要将细胞存放在 –80°C 冰箱。将细胞解冻并转移到装有预热培养基的通气、无挡板摇瓶(non-baffled flask) 中，然后将其置于摇床平台上在 37°C、8%CO2 的条件下孵育，其中轨道直径 25 mm 的摇床速度设为 120 ± 5 rpm，轨道直径 19 mm 的摇床速度设为 125 ± 5rpm。细胞解冻时应具有高存活率，解冻后应快速恢复，在 1–2 次传代时间内达到其正常的 18 小时的倍增时间。

若细胞在1-2次传代后形态上存在严重的结团或连成线状，或者未能恢复至正常的生长周期，可能是在运输或收货时存在问题，则不应该再使用。

在解冻后的 1–2 次传代时间内，ExpiCHO-S 细胞生长的倍增时间应为 18 小时左右。培养瓶中应该仅有少量的细胞聚集，只有达到较高细胞密度 (即：约 6 x 10⁶ 个细胞/mL) 时才会有可见的小细胞团块。如果开始培养时细胞密度为 0.2–0.3 x 10⁶ 个细胞/mL 或0.1–0.2 x 10⁶ 个细胞/mL，则其分别应在 3 天或 4 天内达到约 4–6 x 10⁶ 个细胞/mL 的活细胞密度。如果细胞生长状况不在上述正常范围内，则应进一步优化细胞培养条件。

如果 ExpiCHO-S 细胞解冻后未按上述模式生长——仅仅达到相对较低的细胞密度——通常的解决办法是检查培养物温度，确认设备设置未导致培养体系温度过高。CHO 细胞对较低的温度有极强的耐受性，但是对高温却比 HEK293 细胞更为敏感。培养箱即使设定在 37°C，再加上摇床产生的热量，也会导致培养瓶中的温度超过 CHO 细胞的最适温度。

ExpiCHO-S 细胞培养瓶中培养基的最适温度应为 36.5°C 左右。如果怀疑温度过高，则应调低培养箱温度，使培养瓶中达到最佳培养温度。此时，最好重新解冻一管细胞，而不是尝试使经历过高温条件的细胞恢复正常。而且，任何规模的常规传代和蛋白表达工作均推荐使用无挡板培养瓶。

ExpiCHO-S 细胞生长到约 3 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度时才会到达对数生长期，因此，应在 ExpiCHO-S 细胞达到 4–6 x10⁶ 个细胞/mL 的密度时进行传代，以确保细胞已达到对数生长期。细胞密度接近 6 x 10⁶ 个细胞/mL 时，肉眼可见一些微小的细胞团块；不要试图吹散这些团块，只需待这些团块沉淀后取出细胞悬液进行传代即可。进行所有细胞操作时，只要简单地晃动培养瓶使细胞重悬即可。不要剧烈摇晃或吹打细胞进行混匀，因为这可导致细胞性能受损，特别是转染前已经达到很高密度的细胞。

ExpiCHO-S 细胞解冻后至少应传代两次，并且应达到ExpiCHO 手册中所述的正常生长状态，方可进行转染。如果按照手册中的细胞培养维持指南进行培养，该细胞的性能至少可稳定保持 20 代。

如果细胞密度大大超过 4–6 x 10⁶ 个细胞/mL (即：达到 8–10x 10⁶ 个细胞/mL)，将细胞传代至较正常传代更高的密度(即：以大约 0.5 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度接种新的培养瓶)，待细胞恢复。由于 ExpiCHO-S 细胞属于高密度细胞系，不建议在细胞未达到 4–6 x 10⁶ 个细胞/mL 的对数生长期前进行传代，因为这样会逐渐损害细胞的生长性能。

有一个快速的检查方法，即：将 ExpiCHO-S 细胞以 0.3x10⁶ 个细胞/mL 的密度接种到装有 30 mL ExpiCHO™ 培养基的 125 mL 无挡板培养瓶 (non-baffled flask) 中，然后在接种后第 5、6、7 天检查细胞存活率和活细胞密度。通常，ExpiCHO-S 细胞大约会在接种后第 6 天达到最大细胞密度，接近 20 x10⁶ 个细胞/mL 的密度范围，然后从第 7 天开始逐渐死亡。最终活细胞密度的测定结果将取决于细胞计数方法。不同计数方法获得的结果可能有较大误差。如果细胞呈现显著不同的生长模式，则应优化培养条件。此时，通常可以同时测试多种摇床速度，以确定最适宜细胞生长的速度，然后以此速度开始蛋白表达工作。

不可以。ExpiCHO™ 表达系统能够达到极高的产物滴度，这是因为该系统的组分经过优化，互相配合，达到最佳的蛋白表达效果。ExpiCHO 培养基是一种兼容转染的高密度生长培养基，专门用来与 Gibco™ ExpiCHO™ 养料和 ExpiFectamine™ CHO 增强剂搭配使用。其他培养基无法与 ExpiCHO 系统匹配，可能最终会抑制蛋白表达。

ExpiCHO-S 细胞应于转染前一天以 3–4 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度传代，以便在转染当天达到约 7–10 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度。转染前用新鲜培养基将该细胞稀释至 6 x 10⁶ 个细胞/mL 的最终密度，并轻轻摇晃混匀。剩余细胞应丢弃；不要用高密度细胞继续接种培养。

为了获得最佳效果，建议按以下方法进行 DNA 复合物形成：

1. 用低温 Gibco™ OptiPro 培养基稀释质粒 DNA。
2. 使用时，用低温 OptiPro 培养基稀释 ExpiFectamine CHO试剂，然后立即将其加入到稀释的质粒 DNA 中。
3. 轻轻吹打 1–2 次并且/或者颠倒容器进行混匀；不要涡旋振荡或剧烈吹打。
4. 复合物形成时间应在 30 秒至 5 分钟范围内。

避免延长存放稀释后的 ExpiFectamine CHO 试剂或者ExpiFectamine CHO 试剂-质粒 DNA 复合物反应体系。

如果不能立即将稀释的 ExpiFectamine CHO 试剂加入到稀释的质粒 DNA 中，我们建议您按照试剂盒操作规程将质粒DNA 稀释到将要使用的总复合物体积 (即：正常情况下稀释ExpiFectamine CHO 试剂和质粒 DNA 所需的 OptiPro 培养基总量)，然后将未稀释的 ExpiFectamine CHO 试剂直接加到稀释的质粒 DNA 中。轻轻吹打 1–2 次并且/或者颠倒容器进行混匀。该方法适用于自动化操作或者小规模转染，因为上述情况下不可能或者不方便稀释后立即将 ExpiFectamine CHO 试剂加到质粒 DNA 中。

ExpiFectamine CHO 是一种高效的转染试剂，可以使用显著较低的质粒 DNA 用量进行蛋白表达。较高浓度的 DNA 会对细胞产生更大的应激。试剂盒操作规程中规定的 ExpiFectamine CHO 试剂体积对应的质粒 DNA使用浓度为 0.5–0.8 μg/m；如果 使用比这少的DNA ，则应按比例相应减少 ExpiFectamine CHO 试剂的用量，以获得最佳效果。对大多数蛋白，建议使用 0.6–0.8 μg/mL 的浓度。对于一些易于聚集或者难以表达的蛋白，更低的 DNA 用量可能有利于蛋白的表达。

对于大多数测试过的抗体，1:1 的比例最适合 ExpiCHO 系统。重链/轻链质粒最佳比例取决于二者共转染到同一细胞后的表达速度，有时则要取决于具体的抗体。我们建议按此比例开始，然后针对具体的分子进行必要的调整。我们建议首先将重链和轻链亚基分别克隆到 Invitrogen™pcDNA3.4™ TOPO™ 载体中，然后再优化这两种质粒的比例。我们也测试了一个质粒同时包含重链和轻链基因的方法，结果与前一种方法类似，因此最终的答案要取决于用户的经验和偏好。

ExpiFectamine CHO 转染试剂、ExpiFectamine CHO 增强剂和 ExpiCHO 养料经过优化，可互相配合，达到最高的蛋白表达水平，而且为了方便使用，三者以一套试剂盒的形式提供。ExpiFectamine CHO 转染试剂对高密度培养的细胞有很高的转染效率，优于任何其他转染试剂。与使用聚乙烯亚胺 (PEI) 作为转染试剂相比，使用 ExpiCHO试剂盒按照说明书操作可以获得 30 倍高的表达水平，同时这两种方法中使用减少 50% 的 DNA 用量。

我们建议使用 pcDNA3.4 TOPO TA 载体 (货号：A14697)，以获得最佳表达效果。该载体包含全长 CMV 启动子，在克隆位点下游有一个土拨鼠转录后调控元件 (WPRE)。但是，研究发现其他以 CMV 为基础的载体表达效果与 pcDNA3.4 TOPOTA 载体类似，因此任何以 CMV 为基础的载体都是ExpiCHO系统的理想选择。

ExpiCHO 养料和 ExpiFectamine CHO 增强剂应在转染后 18–22 小时加入，以获得最佳结果。上述试剂可直接加入培养瓶中，无需预热。或者，也可以先将 ExpiCHO 养料和ExpiFectamine CHO 增强剂混合，再加到培养瓶中，以减少操作步骤。如果 使用37°C 条件的标准操作规程操作，建议添加养料和增强剂的时间更靠近 18 小时的时间点。

按照高滴度和最高滴度操作规程调整温度时，建议使用一台专用的 32°C 培养箱，因为将 37°C 培养箱的温度改为 32°C后，培养箱的温度需要很长时间才能降下来，从而影响温度调整的效果。打开培养箱门降温可能会导致污染。

收集时间高度取决于蛋白的性质。对于抗体等稳定蛋白，如果采用标准操作规程我们一般建议在转染后第 7–8 天收集，如果采用高滴度操作规程建议在第 9–10 天收集，如果采用最高滴度操作规程建议在第 11–12 天收集。此时细胞存活率应该仍然很高，理想状况下可达 70–80% 或更高。细胞内蛋白可能需要提早在第 4–7 天时收集。对于易于降解的蛋白，应该考虑设置不同的时间点收集，以确定最佳的收集时间。任何情况下，保持收集时细胞高存活率对蛋白质量和纯化都有好处。

不需要。ExpiCHO™表达系统经设计省略了培养基的换液操作。因此无需在转染操作后去除转染复合物或更换培养基，然而为了增加产量需要添加增强剂和1-2次的养料。

可以，您可以尝试将您的CHO细胞驯化到ExpiCHO培养基中。您的CHO细胞经过长期适应在ExpiCHO™培养基中可能会增加蛋白表达量，且应该能维持高密度的生长。然而，我们无法保证其他CHO细胞系可以达到相当于Expi CHO-S™细胞的表达水平。在有限的测试中，我们发现其他CHO细胞亚克隆在大规模的悬浮培养体系中相对于ExpiCHO-S™细胞更难转染。

我们不推荐用其他培养基替代ExpiCHO™表达培养基，因为其可能无法达到ExpiCHO™表达培养基支持的活细胞密度，同时使用ExpiFectamine™ CHO时其他培养基可能包含一些抑制转染的成分。

可以。如果使用 24 和 96 孔深孔板以及 50 mL 迷你生物反应管进行蛋白表达，请参照以下在线操作规程.

我们的ExpiCHO-S细胞是来源于我们的cGMP banked CHO-S cells (Cat. No. A1155701)，因此CHO-S的稳转筛选方法是可用于这些细胞的。然而，若需要建立稳转的CHO-S克隆，我们推荐使用专门针对该应用的Freedom™ CHO-S™ (Cat. No. A1369601) 或者Freedom™ DG44 (Cat. No. A1373701)试剂盒。

在ExpiCHO™表达系统中测试的多种蛋白，我们获得了相对于FreeStyle™ CHO表达系统大约25-160倍表达量的提高及相对于Expi293™表达系统大约2-4倍表达量的提高。请通过该链接查看ExpiCHO™网页Figure 1中的数据。

对于正常传代及转染时的ExpiCHO-S™细胞，活力大于95%是在ExpiCHO-S™表达系统中获得最佳结果的关键因素。我们建议用台盼蓝染色的方法来检测细胞活力（手动计数或自动Vi-CELL细胞活力分析仪或Cedex分析仪）。台盼蓝染料可选购(货号. 15250061)。

完整的IgG分子可以用设计捕获和检测兔IgG的夹心法ELISA来定量检测。除了兔IgG阳性对照，试剂及试剂盒里包括的其他耗材，您还需要纯化的兔IgG用来作为标准品，F(ab')2羊抗兔IgG HRP结合物(货号. A10547)，蛋白A-包被平板(货号. 15130用于比色检测的透明板), TMB显色底物(货号. 34021)，抗体稀释缓冲液 (货号. 37535)，和用于洗涤的PBS 或 TBS 缓冲液。在我们蛋白A-包被平板手册中有一个例举步骤。请注意，我们的研发科学家是使用配备了蛋白A生物传感器的Pall Life Sciences FortéBio™ Octet™仪器测定细胞培养上清粗提物中的滴度值。

如需在Exp293F™细胞中高产量表达功能性的膜蛋白，我们还准备了Expi293™ MembranePro™ 表达系统（货号A25869，A25870），这款产品将Expi293™的扩展性/易用性与MembranePro™技术整合起来，能够将膜蛋白的表达量大大提升，超出标准贴壁培养MembranePro™功能性蛋白表达系统—产品的表达量20倍以上。

注意：Expi293F™细胞（货号A14527）与pEF6 V5 His TOPO表达载体试剂盒（货号K961020）未包含于Expi293™ MembranePro™表达系统中，因此需单独购买。

不包含。不过，您可于离心后通过肉眼观察管底沉积来判断MembranePro™颗粒是否形成。您也可通过受体-配体结合实验来测试MembranePro™颗粒的功能。 

尽管您可测试其他的表达载体和启动子，不过我们还是建议使用pEF6 V5-His TOPO TA表达载体，因为该试剂盒的性能针对这一包含EF-1α启动子的表达载体进行过专门优化。 

尽管您可测试其他细胞系，不过我们还是推荐您使用Expi293F™细胞，因为该试剂盒的性能（即使用ExpiFectamine™转染试剂所获得的转染效率）针对这一细胞系进行过专门的优化。 

我们表达和测试过50kDa左右的GPCR蛋白。在理论上，对于蛋白的胞外域或跨膜域没有大小限制。不过，如果C-端结构域过大，则可能会存在包装方面的问题。 

请参见应用说明关于使用MembranePro™试剂盒适应Expi293™系统的具体实验方案。

除非您能够解离MembranePro™颗粒，否则gag蛋白无法被除去。我们建议您使用膜蛋白分离的方法，减少gag。本系统得到的定量分析的蛋白中，每次反应得到50-500 μg总蛋白，您的GPCR只占较小部分。

在小规模的起始实验中，G418的存在不会对蛋白生产造成影响。不过，我们并不推荐在大规模蛋白生产过程中（即在生物反应器中）添加G418。

尽管MTX扩增的机理尚不十分清楚，不过人们认为这两个载体会趋向整合于相同的基因组位点，因此也会实现同步扩增。

我们推荐您在建立稳转细胞系之前，将每一蛋白亚基克隆分别克隆至两个载体中，以确定何种载体组合能够在瞬转条件下提供最高的蛋白产量。