用于蛋白高产量生产的哺乳动物细胞表达支持 – 问题排查

按照手册中所描述的直接切换法或序贯切换法来操作，大多数293细胞系均能适应从传统含血清或其它无血清培养基向Expi293™表达培养基中的切换。

尽管Expi293™培养基能够支持更高的细胞密度，但我们并不推荐以超出5–6 x 10⁶个细胞/毫升的密度来培养Expi293™细胞，因为这会降低后续的转染和蛋白表达效率。在更高的细胞密度下，遇到培养活力降低的临界点的可能性也会增加。如果您培养的细胞超出5–6 x 10⁶个细胞/毫升，请按照手册中的描述传代一至两次，监控它们的活力和生长速率。使用蛋白表达对照IgG或得率已知的表达载体来测试转染效果，从而确定细胞表达性能是否受到影响。

我们不推荐用户使用OptiPRO™ SFM来配制DNA–ExpiFectamine™ 293转染复合物。如果您需要一款不含动物源性成份的表达系统，您可使用FreeStyle™ 293表达培养基来制备转染复合物，但请注意这一操作会导致最终的蛋白得率下降10-20%。

新鲜制备的转染复合物所获得的转染效率最佳。不过，这些复合物在至少一小时之内保持稳定。 

请参考应用说明获取在Expi293™表达系统中优化蛋白得率的相关提示。

请参考应用说明获取在96孔微量滴定板中优化Expi293™表达系统的蛋白得率的相关建议。

培养用于转染的细胞应保持起始细胞活力在90%以上。转染后，细胞活力会在3-6天后缓慢降至90%到80%区间，7天乃至更长时间后发生更显著的下降。这是使用我们推荐的实验方案时的情况，该方案不推荐在转染后对培养基进行换液或补充。

我们建议用户对一些参数进行检查，以确保获得高细胞活力：pH在7.0左右，无可见的细胞团块，CO₂水平在7–8%左右（需对该值进行调节以达到适当的pH值），培养体积应为培养瓶标称容积的40%或以下，培养箱温度为37°C。如果您的培养箱中配有振荡平台，则振荡台产生的热量可能足以升高培养箱温度。我们推荐在振荡台上贴一个温度计。如果怀疑培养物的氧气供应不够充分，则使用带挡板的培养瓶可能会有帮助。光照也可能会造成某些培养基成份的降解，我们建议妥善处理和保存培养基。如果您正在使用FreeStyle™ 293表达培养基，则无需添加Pluronic试剂。

注意：细胞聚团的两个主要原因为：1）细胞培养密度过大，和/或2）振荡不充分。因此，充分的搅拌，按照细胞传代时间表规律的传代，并以推荐的密度培养细胞就能够防止细胞聚团。如果发现细胞聚团情况，我们则建议放弃培养物，另取一管新的冻存细胞重新开始培养。用户可能需要在一段时间内每次传代时对细胞剧烈涡旋10-30秒，直至大部分细胞都以单个的形式存在。此外，用户可于每次传代时通过沉降的方式来清除聚团细胞。用户可增加摇床的转速，并确保每次在细胞不超过1.5–2 x 10⁶个细胞/毫升的密度时进行传代。只要细胞活力保持在95%以上时，可增加摇床的转速。在细胞转染后的至少初始2-4小时降低转速，以确保DNA-转染试剂复合物能够良好贴附和进入细胞内。用户也可在最初两次传代时以1:1000（1:200最高）的稀释比例添加抗结团试剂（货号 0010057AE），之后在转染前在不含抗结团试剂的条件下进行传代。请勿在转染过程中的任何时间点添加抗结团试剂，因为该试剂会对转染过程造成干扰。不过，转染数小时之后即可加入抗结团试剂。

您可于离心后通过肉眼观察管底沉积来判断MembranePro™颗粒是否形成。您也可通过受体-配体结合实验来测试MembranePro™颗粒的功能。 

尽管您可测试其他细胞系，不过我们还是推荐您使用Expi293F™细胞，因为该试剂盒的性能（即使用ExpiFectamine™转染试剂所获得的转染效率）针对这一细胞系进行了专门的优化。 

尽管您可测试其他的表达载体和启动子，不过我们还是建议使用pEF6 V5-His TOPO TA表达载体以获得最佳的产量，因为该试剂盒的性能针对这一包含EF-1α启动子的表达载体进行过专门优化。 

在ExpiCHO-S™细胞传代时有一些轻微的细胞结团是正常现象，只要细胞的活力>95%。在每次传代时将培养瓶静置30秒到1分钟，让团块沉到瓶底，然后传代悬浮的细胞。如果细胞活力< 95%并伴随大量结团，说明细胞本身或细胞培养条件存在问题。我们建议验证细胞：是否按照手册中的建议进行培养，低于20代，无污染。有必要复苏一管新的细胞。

不同蛋白之间的产量存在很大差异，我们强烈建议表达兔抗体阳性对照（货号A14662）来确定是否低产量是由于本身是低表达的蛋白，或系统组分存在问题还是转染和培养条件的问题。

如果使用兔IgG阳性对照没有获得预期的产量，我们建议进行如下检查：

• 确保在正常传代及转染时细胞活力>95%。
• 倍增时间大约17小时。
• 细胞复苏后恢复迅速（复苏后3-4天内），如果没有，核实您使用的是手册中提供的培养指南，必要时复苏一管新的细胞。
• 我们建议在所有操作时温和旋转ExpiCHO-S™细胞（避免剧烈旋转，摇晃，和用移液器上下吹打）。验证您的转速，轨道直径25mm摇床速度约为110-125rpm，或轨道直径19mm摇床速度约为125rpm。用一个装有水和温度计的培养瓶进行测试，以确定摇床是否产生多余热量；在必要时降低培养箱的温度设置，以使培养物的最终温度达到37摄氏度。我们在摇床培养时建议使用Corning™无挡板培养瓶；若您使用不同的培养容器，可能需要另外优化转速。

理想的复合物形成时间是5分钟。如果复合物放置达10分钟我们发现蛋白产量会少量下降（约下降20%）；若达20分钟或更久，蛋白产量会骤降（产量下降>50%）。

这种细胞存活率的突然降低往往提示蛋白表达过程中某些细胞培养条件不在最佳状态。发现这种问题时，应确认摇床速度在操作规程规定范围内；培养体积与培养瓶尺寸应相配；开始蛋白表达前操作 ExpiCHO-S 细胞时应小心，确保细胞不会因剧烈混匀动作而发生应激，等等。

有时，按照高滴度或最高滴度操作规程使用 125 mL 培养瓶培养时，不同瓶之间会有差异。此时，建议将 25 mm 摇床和19 mm 摇床的摇床速度分别提高到 130 rpm 和 140 rpm。

另外，我们发现如果使用 125 mL 培养瓶，那么有挡板培养瓶(baffled flask) 的效果更好，可消除不同瓶之间的差异——此时，考虑到挡板的影响，应将转染的细胞悬液量从 25 mL 增加到 35–40 mL，使其在挡板上达到最佳流动效果，同时其他试剂量也应相应调整。

使用有挡板培养瓶时也可使用较少的转染体积 (即 30–35mL)；但此时考虑到挡板的影响，应稍微降低摇床速度 (即：将19 mm 摇床和 25 mm 摇床的速度分别设为 115 rpm 和 110rpm)。我们发现对于其他尺寸的培养瓶，使用有挡板培养瓶既无必要，也无益处。

由于 ExpiCHO 系统所用组分不同于以 HEK 293为基础的表达系统 (如：Gibco™ Expi293 系统)，因此有时上清液可能较难通过普通的瓶顶过滤器进行处理。 解决这一问题时，我们建议首先将上清液以大约 5,000 x g 的离心力离心 30 分钟，然后再用 0.22 μm 过滤器过滤。其他过滤器 (如深层过滤器) 能提供更出色的上清液过滤性能，尤其是对较大的培养规模，因为此类过滤器专为处理 CHO 类表达系统的上清液而设计。