哺乳动物细胞表达的慢病毒基因转入 - 疑难解答

我们强烈建议使用Stbl3™大肠杆菌来克隆慢病毒载体。Stbl3™大肠杆菌的基因组中携带了recA13突变，能够帮助减少LTR之间发生不必要重组事件的可能性。在转化Stbl3™大肠杆菌之后，我们推荐用户挑取克隆并通过Afl II和Xho I消化和和小量制备操作来对慢病毒DNA进行验证。我们所推出的全部慢病毒载体的5'和3’LTR中均含有Afl II位点，而MCS的3'端还有一个Xho I位点。假设Afl II仅在LTR位点中进行切割，而插入片段中不含Afl II或Xho I位点，则AfI II + Xho I消化预期会产生3段 DNA片段。任何非预期的DNA片段都将推定为LTR重组的结果。只有符合预期的DNA片段切割模式的克隆会被挑出，而进入后续的中量制备步骤。

通过小量制备获得慢病毒DNA的得率一般非常低，这是由于载体骨架中存在着LTR序列的缘故。因此，我们不推荐通过小量制备试剂盒来提取慢病毒质粒。我们推荐用户使用S.N.A.P.TM中量制备试剂盒（MidiPrep Kit，货号K191001）或PureLink HiPure质粒中量制备试剂盒（货号K210004）来制备慢病毒载体DNA，这两款试剂盒的重悬缓冲液（Resuspension Buffer）中均包括10 mM EDTA。由于慢病毒DNA的中量制备通常得率也较低，我们推荐用户依照专用实验方案进行操作，以提高得率——简言之，慢速培养细胞、每个抽提提柱加入少量细胞、每次DNA中量制备使用100 mL慢病毒培养物。

注意：如果您希望在克隆操作/克隆筛选过程中小量制备慢病毒质粒，我们推荐您使用PureLink HQ小型试剂盒（Mini Kit，货号K210001），并按照说明书来开展实验，只有一处需要优化：使用50 mL TE，pH 8.0缓冲液洗脱一次。通过该方法获得的DNA得率一般极低——100–150 ng/mL（即一共5–7 mg）。其OD 260/280的通常介于1.8和2.1。

如果转染后不久（4小时至过夜）293FT细胞就从平板上脱离下来：

• 这可能是Lipofectamine 2000的毒性所致。可能在转染前细胞种植密度过低。
• 用户对这些细胞的操作可能不够轻柔（这些细胞会有易于漂浮的倾向）。 
• 这些细胞可能在室温条件下放置时间过长。

如果在转染48-72小时内细胞脱离：

• 如果细胞大片脱离，这可能是慢病毒产生的一个标志。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：

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这可能是由于在筛选过程中应用了过量的杀稻瘟素所致。通过开展杀伤曲线分析来确定您所用细胞系的抗生素敏感性。使用能够有效杀灭未转导细胞系的最低抗生素浓度。

使用HiPerform™ FastTiter™慢病毒载体转导细胞细胞所获得的EmGFP信号水平，未针对荧光显微镜的视觉评估应用进行专门优化。因此在使用这些载体时，我们推荐用户仅通过流式细胞术来检测转导细胞中的EmGFP荧光。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：

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这可能是由Lenti6.3/TO/V5-DEST载体转导进不表达Tet抑制子的细胞所致。首先建立一株ViraPowerTM T-RExTM细胞系，之后将其作为Lenti6.3/TO/V5-DEST的宿主。您可能需要确认在细胞生长培养基中未使用含较高四环素水平的FBS。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：