비오틴화에 대한 지침

비오틴화는 생체분자의 분리, 농축, 추가 다음 단계 공정 및 분석을 위해 널리 사용됩니다. 표적 분자를 올바르게 비오틴화해야만 Streptavidin-Coupled Dynabeads®와의 높은 결합 효율을 보장할 수 있습니다.

일차 아민, sulfhydryls, carboxyl, carbohydrate, tyrosine, histidine side chain 및 guanidine, cytosine 염기와 같은 여러 작용기를 표적화하는 다양한 상용 비오틴화 시약이 출시되어 있습니다. 모든 비오틴 시약은 길이 6 C-atom 이상의 spacer arm을 함유하여 입체 방해를 줄여야 합니다. 15 carbon arm spacer를 갖는 biotin-TEG와 같이 긴 carbon arm을 갖는 여러 비오틴 변형을 이용하여 입체 방해를 줄일 수 있습니다.

단백질 및 펩티드의 비오틴화

항체, 단백질, 펩티드에 간편하고 효율적으로 비오틴을 표지할 수 있는 다양한 상용 비오틴화 키트가 출시되어 있습니다. 다양한 spacer arm 길이를 갖는 비오틴은 streptavidin 결합과 관련된 입체 방해를 줄이고 비오틴화된 단백질을 효율적으로 포획하도록 지원합니다. 비오틴화 시약은 수용성 또는 비용해성입니다. 또한, 다양한 기(group)에 대한 반응도 나타내므로 단백질 또는 펩티드의 일차 아민, 이차 아민, carboxyl 또는 phosphate 기에 결합할 수도 있습니다. UV 광선을 통해 광활성되면 단백질과 다른 생체분자와 광반응성 비오틴 화합물도 이용할 수 있습니다.

따라서 표적 분자를 비활성화하지 않고도 어플리케이션별로 최적의 비오틴화 시약을 선택할 수 있습니다.

Dynabeads®에서 DNA의 높은 안정성과 결합력 덕분에 유리 용액에서 DNA의 반응속도와 유사한 반응속도를 갖는 표적 단백질을 결합할 수 있습니다.

올리고뉴클레오티드의 비오틴화

비오틴 표지 DNA/RNA 표적 염기서열을 비드에 고정하고 세포 추출물로 배양합니다. 그런 다음 자석 분리를 사용해 결합된 단백질을 분리할 수 있습니다. 특징 분석을 위해 단백질을 용출시켜 제거하거나 전체 고체상 복합체를 DNase 족적법(footprinting) 연구 등에 적용할 수 있습니다.

염기서열에서 비오틴 분자 2개를 갖는 이중 비오틴은 streptavidin을 통해 결합력을 높일 수 있습니다. 이것은 높은 온도에서 가열하는 동안 비오틴화된 DNA/primer를 비드에 유지시키는 데 도움이 되지만, 많은 고객에게 이 작업은 아직 과제로 남아 있습니다. 이중 비오틴은 가열 중에 비드에서 비오틴화된 DNA 누출을 방지하거나 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났습니다(9).

정제 옵션:
샘플의 유리 비오틴은 streptavidin에서 결합 부위를 점유하여 비드 결합력을 약화시키기 때문에 효과적으로 제거해야 합니다. 비오틴화된 올리고뉴클레오티드는 다음 옵션 중 하나를 사용해 비결합 비오틴에서 정제해야 합니다.

• 카트리지
• HPLC (4)
• 페이지

oligo 정제 옵션에 대한 자세한 정보

기타 핵산 비오틴화 기법

1. 비오틴화된 primer와 함께 PCR을 사용한 말단 표지(5, 6)
2. 비오틴 dUTP 표지의 효소 접합
3. 비오틴 dUTP 표지를 말단 표지를 통해 Klenow DNA 중합효소, nick translation, 혼합된 primer 표지(5, 6) RNA 중합효소(T7, T3 포함)를 사용해 효소 방식으로 이중 가닥 DNA 분절에 접합하고, SP6 RNA 중합효소가in vitro전사 반응에서 dUTP를 RNA 전사물(transcript)에 접합할 수 있습니다.
4. 광비오틴화

광활성 비오틴은 DNA 분절 이중 가닥 DNA와 단일 가닥 DNA나 RNA에서 무작위로 접합 가능합니다. 간단히 광활성 비오틴을 샘플에 첨가하고 UV 광선으로 조사 처리합니다.

비오틴화된 PCR 산물 정제

Dynabeads® Streptavidin을 사용하면, 비오틴화된 PCR 산물을 정제하지 않아도 되고, 비드를 PCR 반응에 직접 첨가하여 비오틴화된 PCR 산물을 포획할 수 있습니다. 그렇지만, 미사용 비오틴화된 primer의 농도가 높은 경우에는 비드를 PCR 반응에 첨가하기 전에 제거하는 것이 좋습니다. PCR 반응에서 과도하게 비오틴화된 primer는 비드 결합력을 약화시킵니다. 제한적인 농도의 비오틴화된 primer를 사용해 PCR을 실행하거나, PCR 정제 키트를 사용해 유리 비오틴화된 primer를 제거합니다.


PCR 정제 키트에 대해 자세히 보기

절단 가능 시약을 사용한 비오틴화

streptavidin-비오틴 반응은 단백질과 리간드 사이에서 가장 강력하다고 알려진 비공유 결합이자 생물학적 상호작용입니다. 비오틴과 streptavidin 간 결합은 매우 빠르게 형성됩니다. 또한 일단 형성되고 나면 넓은 범위의 pH, 온도, 유기 용매, 기타 변성 제제의 영향을 받지 않습니다. 그러므로, 흔히 매우 강한 방법을 사용해 streptavidin에서 비오틴을 해리해야 하는 데, 이로 인해 streptavidin이 불리하게 변성됩니다. 유도체 형태의 비오틴을 사용하면 streptavidin에서 비오틴을 부드럽게 해리할 수 있습니다. 여러 절단 가능 또는 가역적 비오틴화 시약을 사용해 streptavidin에서 부드러운 방식으로 비오틴화된 분자를 특이적으로 용출시킬 수 있습니다.

절단 가능 시약을 사용해 다음과 같은 다양한 방법으로 비오틴화를 실시할 수 있습니다.

1. 절단 가능 linker를 사용한 비오틴 dUTP 유사체의 효소적 접합. 이황화결합은 dithiothreitol(DTT)로 쉽게 절단되기 때문에 이황화결합을 포함하는 linker arm을 사용해 비오틴을 접합하면 DNA 분절을 간단하게 해리할 수 있습니다. 이 시약은 말단 표지, nick translation, 혼합 primer 표지 중 하나를 통해 효소적인 방법으로 DNA 분절에 접합됩니다.
2. NHS 비오틴 guanido 유사체의 화학적 접합.
3. biotin-X-NHS-Ester를 사용한 단백질의 화학적 접합(1). NHS-비오틴은 절단 가능 이황화결합을 포함하므로 원하는 단백질을 비오틴/streptavidin 복합체에서 쉽게 절단할 수 있습니다(2). Thiol 절단 가능 NHS-활성화 비오틴은 pH 7-9 버퍼에서 일차 아민기(-NH2)와 효율적으로 반응하여 안정적인 amide 결합을 형성합니다.
4. DSB-XTM Biotin Protein Labeling Kit. 이 키트는 소량의 항체나 다른 단백질을 고유한 DSB-X 비오틴 리간드로 효율적으로 표지해 줍니다. DSB-X 비오틴은 desthiobiotin의 유도체로서 streptavidin 및 avidin과 같은 비오틴 결합 단백질을 결합할 수 있는 안정적인 비오틴 전구체입니다. 강한 chaotropic 제제 및 낮은 pH(6.0 M guanidine HCl, pH 1.5)는 비오틴과 streptavidin 또는 avidin 사이에서 형성되는 안정적인 복합체를 해리해야 하지만, DSB-X 비오틴은 실온과 중성 pH에서 과량의 D-biotin 또는 D-desthiobiotin을 적용하여 쉽게 대체 가능합니다.

1. Coffer A, Smith JS, Rozengurt E (1990) Bombesin receptor from Swiss 3T3 cells. Affinity chromatography and reconstitution into phospholipid vesicles. FEBS 275(1):159–164.
2. Ahmed ARH et al. (1992) Isolation and partial purification of a melanocyte-stimulating hormone receptor from B16 murine melanoma cells. A novel approach using a cleavable biotinylated photoactivated ligand and streptavidin coatedmagnetic beads. Biochem J  286(2):377–382
3. Ozyhar A, et al. (1992) Magnetic DNA affinity purification of ecdysteroid receptor. J Steroid Biochem Mol Biol 1992;43(7):629–634.
4. Hultman T, et al. (1990) Solid phase in vitro mutagenesis using plasmid DNA template. Nucleic Acids Res 18(17):5107–5112.
5. Sambrook J, et al. (1989) Molecular cloning; A Laboratory Manual. 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY
6. Wahlberg J, et al. (1994) Solid phase sequencing of PCR products. In: McPherson MJ, ed. PCR II - A Practical Approach. Oxford: IRL Press, Oxford University Press.
7. Nelson WM, Wojnar WA (1991) The use of photobiotinylated PCR primers for magnetic bead-based solid phase sequencing. Human Genome III October 21–23 San Diego, CA. Poster no. T41.
8. Gibbs RA, et al (1990) Multiplex DNA deletion detection and exon sequencing of the hypoxanthine Phosphoribosyltransferase gene in Lesch-Nyhan families. Genomics 7:235–244.
9. Dressman D et al (2003) Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. PNAS 100(15):8817–8822.