Subtractive hybridization은 특정 조직이나 세포 유형 또는 특정 단계에서 유전자 발현을 연구하는 강력한 기법입니다. 기존 절차는 흔히 기술적으로 복잡하고 수작업이 많은 방법으로, 대량의 mRNA가 필요하여 위양성 및 재현 불가능한 결과를 야기할 수 있습니다.

고체상 cDNA
Dynabeads® Oligo(dT)25 는 차별적으로 발현되는 희귀 mRNA를 스크리닝하고 분리하기 위해 subtracted cDNA probe를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 비드에서 포획된 mRNA를 포획하는 대신 비드가 결합된 oligo-dT 염기서열을 사용해 cDNA 합성을 프라이밍하여 특정 세포 유형이나 조직에 특이적인 고체상 cDNA 라이브러리를 생성합니다(1-11).

장점

  • subtracted probe 또는 subtracted cDNA 라이브러리를 생성하는 간편하고, 빠르고, 신뢰할 수 있는 방법
  • 소량의 샘플/mRNA만이 필요
  • 자기 취급은 각 단계마다 손실 최소화
  • 특이적 mRNA가 상당히 농축됨
  • 자기 취급을 통해 간편하고 빠른 버퍼 변화가 가능하여 hybridisation 및 특정 효소 반응을 최적화
  • subtractor Dynabeads®는 쉽게 재생, 저장, 재사용할 수 있습니다.


방법 I
표적 물질의 mRNA는 Dynabeads®에서 고정된 subtractor 물질의 첫 번째 가닥 cDNA로 교잡됩니다. subtracted mRNA는 포획된 공통 mRNA로 비드 결합 subtractor cDNA를 자기 분리한 후 상층액에 남겨지고, subtractor 비드를 다시 사용할 수 있습니다. 최종 교잡 단계 이후에 subtracted 특이적 mRNA는 방사성 동위원소 표지된 cDNA로 역전사되고 cDNA 라이브러리(5, 10)를 스크리닝하거나 cDNA 클로닝에 사용됩니다(9). subtractor와 표적 mRNA 군집이 작을 때 대량의 표적 특이적 mRNA를 확보하기 어렵고 Lambert(11)의 PCR 기반 방법이 더 적절할 것입니다. 작동 원리는 이 그림을 참조하십시오.


방법 II
대안은 표적 및 subtractor mRNA에서 고정된 cDNA 라이브러리를 생성하는 것입니다(2, 4). 두 번째 가닥 cDNA는 용출되어 과잉의 고정 subtractor cDNA와 혼합된 표적 cDNA와 분절을 무작위로 프라이밍하여 합성됩니다. 공통 분절은 annealing되고 제거되지만, 상층액에 남는 고유한 분절은 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 probe로 사용됩니다(2, 8). mRNA 분량이 제한적이거나 mRNA 공급원 2개가 매우 비슷할 경우, 이 물질은 수 차례의 subtraction를 실행하기에 불충분하거나 스크리닝 용도로 남은 물질이 불충분할 수 있습니다. 이러한 문제는 subtracted cDNA 분절을 고정된 subtractor cDNA로 다시 annealing하여 해결할 수 있습니다. 그리고 나면 생성된 이중 가닥 cDNA가 절단되고, linker가 결합되고, 분절이 PCR을 통해 증폭됩니다(3). 작동 원리는 이 그림을 참조하십시오.

Learn more
Ordering information

See all protein A and G magnetic beads
See all streptavidin-coupled magnetic beads
See all secondary antibody-coupled magnetic beads
See all magnetic beads for tagged protein isolation and pulldown
See Dynabeads Oligo(dT)25 magnetic beads

선정된 참고문헌

  1. Camerer E et al. Binding of Factor VIIa to tissue factor on keratinocyte induces gene expression.J. Biol. Chem. 2000;275(9):6580-6585.
  2. Rodriguez IR and Chader GJ. A novel method for the isolation of tissue-specific genes. Nucl.Acids.Res.1992;(13):3528.
  3. CocheT, Dewez M and Beckers M-C. Generation of an unlimited supply of a subtracted probe using magnetic beads and PCR. Nucl. Acids Res. 1994;22(7):1322-1323.
  4. Schoen TJ et al. Isolation of candidate genes for macular degeneration using an improved solid-phase subtractive cloning technique. Biochem.Biophys.Res.Commun.1995; 21(1)181-188.
  5. Aasheim H-C, Logtenberg T and Larsen F. Subtractive hybridization for the isolation of differentially expressed genes using magnetic beads. Meth. Mol. Biol. 1996; 69:115-128.
  6. Leygue ER, Watson PH and Murphy LC. Identification of differentially expressed genes using minute amounts of RNA. BioTechniques 1996;21(6):1008-1012.
  7. Hampson N, Hampson L and Dexter TM. Directional random oligo-nucleotide primed (DROP) global amplification of cDNA: its application to subtractive cDNA cloning. Nucl. Acids Res. 1996;24 (23): 4832-4835.
  8. Schraml P, Shipman R, Stulz P, Ludwig CU. cDNA subtraction library construction using a magnet-assisted subtraction technique (MAST). Trends Genet 1993;9:70-71.
  9. Sharma P, Lönneborg A, Stougaard, P. PCR-based construction of subtractive cDNA library using magnetic beads. BioTechniques 1993;15(4):610-611.
  10. Aasheim H-C, Deggerdal A, Smelang EB, Hornes E. A simple subtraction method for the isolation of cell-specific genes using magnetic monodisperse polymer particles. BioTechniques 1994;16(4):716-721.
  11. Lambert KN and Williamson VM. DNA library construction from small amounts of RNA using paramagnetic beads and PCR. Nucleic Acid Res 1993;21:775-776.