글라이칸(glycan) 분석 정보

단백질 바이오치료제에서 당화(glycosylation) 패턴의 변화는 약물의 반감기, 안정성, 안전성 및 약효에 영향을 주는 것으로 알려져 있습니다. 일반적으로 글라이칸은 O-결합 및 N-결합 글라이칸과 같이 두 가지 종류의 주요 그룹으로 구분됩니다. O-결합 당화(glycosylation)는 산소 원자를 매개로 올리고당이 세린 또는 트레오닌 아미노산 잔기에 결합하는 과정에 관여하며, N-결합 당화(glycosylation)는 질소 원자를 매개로 올리고당이 아스파라긴 아미노산 잔기에 결합하는 과정에 관여합니다.

60% 이상의 치료제용 단백질은 N-결합 또는 O-결합 글라이칸 추가에 의한 생합성에 따라 번역 후(post translationally) 변형됩니다. 바이오치료제의 당화는 pH, 탄소원, 용존 산소, 제조 과정의 온도와 같은 여러 공정 관련 인자를 비롯하여 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

당화(glycosylation)는 단백질의 가장 흔한 번역후 변형(post-translational modification) 과정이지만 분석적 관점에서는 가장 분석이 까다로운 분야이기도 합니다. 바이오치료제의 일관된 당화(glycosylation) 패턴을 유지하기 위해서는 효율적인 제조 공정과 효과적인 글라이칸 특성화가 필수적입니다. 당단백질에 대한 포괄적인 분석은 서로 다른 다양한 분석적 접근법을 사용하여 올리고당의 일차 구조 및 개별 당화 부위에서의 변이형에 대한 정보를 제공합니다.

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무손상 원형(intact) 당단백질(glycoprotein) 프로파일링은 당화(glycosylation) 패턴과 정도를 확인하는 데 사용합니다. 결합된 글라이칸 성분의 이질성으로 인해 무손상 원형(intact) 당단백질 프로파일링은 크로마토그래피 분리를 결합한 고분해능 정밀질량(HRAM) 질량분석법(MS)을 사용하여 가장 효과적으로 수행할 수 있으며 단백질 또는 바이오치료제에 존재하는 다양한 당형(glycoform)에 대한 종합적인 통찰력을 제공합니다.

또한 글라이칸 분석은 당화 부위에서 글라이칸 조성 및 펩타이드 서열을 모두 얻기 위해 펩타이드 수준에서 수행할 수 있습니다.

특정 글라이칸 화학종 모니터링 또는 특정 글라이칸 세트의 상대적 양 측정은 바이오치료제의 개발을 위한 중요한 정보를 제공합니다. 글라이칸 구조의 복잡성으로 인해 단백질에서 글라이칸이 분리된 직후에 정량 분석과 식별이 수행됩니다. N-결합 글라이칸은 효소 처리를 통해 분리하며, O-결합 글라이칸은 분리를 위한 효소가 존재하지 않기 때문에 화학적 방법을 통해 분리합니다. 글라이칸에는 발색단이 없기 때문에 기존 LC-UV 검출법에 잘 반응하지 않습니다. 따라서 많은 경우 LC-형광 검출법을 통한 고감도 분석에 앞서 형광 태그로 라벨링(labeling)합니다. 이 때 가장 자주 사용되는 라벨은 2-아미노벤자미드(2-AB)입니다. MS는 글라이칸 구조 규명을 위한 가장 강력한 도구로 부상하고 있습니다. 하지만 대부분의 글라이칸은 효과적으로 이온화가 되지 않기 때문에 감도를 개선하기 위해 2-AB 라벨링(labeling)도 함께 수행할 수 있습니다.

프룩토스, 갈락토사민, 글루코사민, 갈락토스, 글루코스 및 만노스 등으로 구성되는 단당류 조성은 일상적으로 단백질에 결합된 당 단위의 개수와 조성으로 결정되며 바이오치료제의 효능에 영향을 줄 수 있습니다. 단당류는 약산이기 때문에 기본 조건 하에서 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있습니다. 시료는 단당류 분리를 위해 산으로 가수분해되며 크로마토그래피 분리 후 펄스 전기화학 검출과 결합한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAE-PAD)를 사용하여 분석됩니다.