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ADC 발견을 위한 항체 내재화 및 분해 어세이 |
차세대 내재화 및 분해 어세이로 항체-약물 콘주게이트 발견 워크플로우를 간소화할 수 있습니다
항체가 세포 표면 수용체에 결합할 때 엔도시토시스(endocytosis)를 트리거하여 수용체와 항체를 세포에 내재화합니다. 이 과정은 특히 항체-약물 콘주게이트(ADC)를 사용하는 암 세포에 대한 표적 약물 전달 연구에 매우 중요합니다. ADC는 강력한 세포독성 분자와 연결된 엔지니어링된 항체로서 약물 방출 및 종양 세포 사멸을 위해 리소좀으로 이동되거나 엔도솜 경로를 통해 재활용될 수 있습니다.
세포 내 이동 경로를 이해하는 것은 약물 발견을 진전시키는 데 매우 중요합니다. ADC 또는 항체는 pH 민감성 pHrodo dye와 결합하여 내재화를 모니터링하거나 LysoLight dye와 결합하여 리소좀 분해를 확인할 수 있으며 효과적인 약물 발견을 위한 사용이 간편한 도구를 제공합니다.
pHrodo dye 또는 LysoLight dye 기반 분석 제공:
내재화 및 분해 어세이 선택 가이드
| pHrodo Green | pHrodo Red | pHrodo Deep Red | |
|---|---|---|---|
| 소기관 | 초기 엔도솜부터 리소좀까지 | 후기 엔도솜 및 리소좀 | |
| 일반적인 필터 세트 | FITC/GFP | TRITC/RFP | Cy5 |
| Ex/Em(nm) | 509/533 | 560/585 | 640/655 |
| 신호 대 잡음비 |  |  |  |
| 광안정성 | | | |
| 밝기 | | | |
| pKa* | 6.5 | 6.5 | 5 |
| 멀티플렉싱 | 예 | ||
| Live/Fixed cells | Live | ||
| 응용 분야 | 이미징, high content analysis, 유세포 분석 | ||
| SiteClick 위치 특이적 | — | C20034 | S10914 |
| Zenon Fab 단편 | Z25609 (Mouse) Z25611 (Human) Z25613 (Human 5x) | Z25610 (Mouse) Z25612 (Human) Z25614 (Human 5x) | |
| 아민-반응성 라벨링 키트 | P36015(20 μg) P36022(100 μg) P36023(1mg) | P36014 (20 μg) P36020(100 μg) P36021(1mg) | P35355 (100 μg) P35356 (1mg) |
| 아민-반응성 시약 | P36013 | P36011 | P35359 |
* 환경 pH가 pKa에 도달하기 전에 신호가 나타납니다.
| pHrodo Green | pHrodo Red | pHrodo Deep Red | |
|---|---|---|---|
| 소기관 | 초기 엔도솜부터 리소좀까지 | 후기 엔도솜 및 리소좀 | |
| 일반적인 필터 세트 | FITC/GFP | TRITC/RFP | Cy5 |
| Ex/Em(nm) | 509/533 | 560/585 | 640/655 |
| 신호 대 잡음비 | | | |
| 광안정성 | | | |
| 밝기 | | | |
| pKa* | 6.5 | 6.5 | 5 |
| 멀티플렉싱 | 예 | ||
| Live/Fixed cells | Live | ||
| 응용 분야 | 이미징, high content analysis, 유세포 분석 | ||
| SiteClick 위치 특이적 | — | C20034 | S10914 |
| Zenon Fab 단편 | Z25609 (Mouse) Z25611 (Human) Z25613 (Human 5x) | Z25610 (Mouse) Z25612 (Human) Z25614 (Human 5x) | |
| 아민-반응성 라벨링 키트 | P36015(20 μg) P36022(100 μg) P36023(1mg) | P36014 (20 μg) P36020(100 μg) P36021(1mg) | P35355 (100 μg) P35356 (1mg) |
| 아민-반응성 시약 | P36013 | P36011 | P35359 |
* 환경 pH가 pKa에 도달하기 전에 신호가 나타납니다.
pHrodo dye 기반 어세이를 사용한 내재화 분석
Invitrogen pHrodo 키트 및 시약은 pH 민감성 기술을 활용하여 연구자들이 높은 특이도로 엔도시토시스(endocytosis) 또는 식세포작용(phagocytosis) 연구를 수행할 수 있도록 합니다. 적색, 녹색 및 진한 적색으로 제공되는 pHrodo dye는 세포외 환경의 중성 pH에서 무형광입니다. 엔도솜 또는 리소좀의 산성 환경으로 내재화해야만 pH 민감성 염료(dye)는 밝은 형광을 나타냅니다. 이를 통해 백그라운드 형광을 최소화하고 내재화 분석에서 소광제 또는 세척 단계를 사용하지 않고 검출을 가능하게 합니다.
Invitrogen pHrodo dye의 pH 민감성 기술은 다른 라벨링 기술과 결합할 수 있습니다. 여기에는 특이적인 내재화 분석의 요구를 충족시키기 위한 SiteClick 항체 라벨링 및 신속 Zenon 항체 라벨링이 포함됩니다.
pHrodo Deep Red는 pHrodo Red 및 Green보다 pKa가 낮으므로 엔도시토시스 경로의 후반까지 형광을 보이지 않습니다. 이러한 지연된 형광을 통해 엔도시토시스 경로 내의 다양한 단계를 모니터링할 수 있어 내재화 프로세스에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
그림 1.낮은 pKa pHrodo Deep Red는 후기 엔도솜과 리소좀에 최적화되어 있습니다. Herceptin(유방암 및 위암 치료에 사용되는 단클론 항체)에 pHrodo Deep Red를 라벨링했습니다. SKBR3 세포를 pHrodo Deep Red–labeled Herceptin 및 CellLight Early Endosome-RFP(왼쪽), CellLight Late Endosome-RFP(중앙), CellLight Lysosomes-RFP(오른쪽)로 처리했습니다. 밤새 인큐베이션한 후 시료를 37˚C에서 30분 동안 NucBlue Live 핵 염료로 염색했습니다. EVOS M7000 세포 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미지를 획득하고 오버레이했습니다. 중첩된 형광 신호(흰색으로 표시)는 pHrodo Deep Red(자홍색)로 라벨링된 내재화된 Herceptin 항체가 후기 엔도솜과 리소좀에서는 형광을 보이지만 초기 엔도솜에서는 형광을 보이지 않음을 보여줍니다. 이러한 데이터는 후기 엔도솜과 리소좀에서 발견되는 5.5–6.0의 보다 산성화된 pH가 pHrodo Deep Red를 비형광에서 진한 적색 형광으로 활성화하는 데 필요하다는 것을 시사합니다.
SiteClick pHrodo 라벨링 시스템은 항체 내재화 연구를 위해 pHrodo dye를 항체에 부착하기 위해 구리가 없는 클릭 화학 기술을 활용합니다. pHrodo dye의 위치 특이적인 부착은 보다 정확한 연구를 위해 백그라운드 노이즈를 최소화하는 동시에 항체 기능을 유지합니다.
SiteClick Azido Modification Kit는 IgG 항체의 중쇄에 있는 탄수화물 영역에 azido 부분을 부착합니다. 이러한 변형을 통해 SiteClick sDIBO alkynes를 사용함으로써 pHrodo dye 또는 기타 라벨을 사용한 특이적이고 재현성 있는 항체 라벨링을 수행할 수 있습니다. 그런 다음, 연구자들은 그 결과로 만들어진 콘주게이트를 사용하여 항체-약물 콘주게이트 개발에서 세포 내 이동을 자세히 모니터링할 수 있습니다.
그림 2. SiteClick 항체 라벨링 개요. SiteClick 항체 라벨링 프로세스의 첫 번째 단계는 β-갈락토시다아제를 사용하여 항체의 중쇄 N-연결 글리칸에서 말단 갈락토스 잔기를 제거하여 가능한 모든 변형 가능한 GlcNAc 잔기를 노출시키는 것입니다. 둘째, GalT(Y289L) 효소를 사용하여 GalNAz를 말단 GlcNAc 잔기에 효소적으로 부착함으로써 유리 말단 GlcNAc 잔기가 아지드 태그로 활성화됩니다. 세 번째 단계에서 아지드 잔기는 dibenzocyclootyne(DIBO) 기능화 프로브(예: pHrodo Red 또는 Deep Red sDIBO alkyne)와 반응합니다. 평균 라벨링 정도는 항체당 3–3.5개 라벨입니다.
Invitrogen Zenon pHrodo IgG Labeling 시약은 신속한 항체 내재화 스크리닝을 위해 pH 민감성 pHrodo dye를 사용하여 효율적인 Zenon 항체 라벨링 기술을 활용합니다. Zenon은 pHrodo 또는 Alexa Fluor dye와 결합된 Fab 단편을 사용하는 비공유 라벨링 방법입니다. 이 Fab 단편은 인간 또는 생쥐 IgG 항체의 Fc 부분과 결합하여 5분 이내에 라벨링 복합체를 형성합니다.
Zenon pHrodo 라벨링된 Fab 단편은 표적 세포에서 항체 섭취 및 이동에 대한 형광-기반 표시를 제공합니다. pH가 산성 상태가 되면 pHrodo dye는 형광이 증가합니다. 따라서 Zenon pHrodo 라벨링 시약은 세포에 의해 섭취된 라벨링된 항체의 산성화에 기반하여 엔도시토시스 활동을 측정하는 데 매우 적합합니다.
그림 3. SKBR3 세포의 내재화 연구. 항트랜스페린 수용체의 5배 연속 희석액을 10 ng/mL~0.64 pg/mL 으로 준비하였으며 Zenon pHrodo Deep Red Mouse IgG 라벨링 시약을 최종 분석 농도인 200 nM으로 일정하게 유지하였습니다. 5분 라벨링 후, SKBR3 세포를 라벨링된 항체로 처리하였습니다. 37°C 및 5% CO2에서 16시간 내재화 후 세포를 CellInsight CX7 LZR Pro HCS 이미징 시스템에서 이미징하고 정량하였습니다.
pHrodo dye 기반 어세이 주문 정보
| 이름 | 라벨링 스케일 | 제품 번호 |
|---|---|---|
| SiteClick Antibody Azido Modification Kit (sDIBO label is not included order separately) | 100 mg | S20026 |
| Click-iT pHrodo iFL Red sDIBO Alkyne for Antibody Labeling | 100 mg | C20034 |
| SiteClick pHrodo Deep Red sDIBO Alkyne | 250 μg | S10914 |
| SiteClick pHrodo Deep Red sDIBO Alkyne | 1 mg | S10915 |
| SiteClick pHrodo iFL Red sDIBO Alkyne | 1 mg | S10903 |
| SiteClick pHrodo iFL Red sDIBO Alkyne | 5 mg | S10908 |
| 이름 | 라벨링 스케일 | 제품 번호 |
|---|---|---|
| Zenon pHrodo iFL Green Mouse IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25609 |
| Zenon pHrodo iFL Red Mouse IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25610 |
| Zenon pHrodo iFL Green Human IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25611 |
| Zenon pHrodo iFL Red Human IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25612 |
| Zenon pHrodo iFL Green Human IgG Labeling Reagent 5x | 최대 20개의 96 웰 플레이트 | Z25613 |
| Zenon pHrodo iFL Red Human IgG Labeling Reagent 5x | 최대 20개의 96 웰 플레이트 | Z25614 |
| Zenon pHrodo iFL Deep Red Mouse IgG Labeling reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25622 |
| Zenon pHrodo iFL Deep Red Human IgG Labeling reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25618 |
| 이름 | 라벨링 스케일 | 제품 번호 |
|---|---|---|
| pHrodo Deep Red Antibody Labeling Kit | 3 x 100 µg | P35355 |
| pHrodo Deep Red Antibody Labeling Kit | 3 x 1 mg | P35356 |
| pHrodo iFL Red Microscale Protein Labeling Kit | 3 x 20 µg | P36014 |
| pHrodo iFL Red Antibody Labeling Kit | 3 x 100 µg | P36020 |
| pHrodo iFL Red Antibody Labeling Kit | 3 x 1 mg | P36021 |
| pHrodo iFL Green Microscale Protein Labeling Kit | 3 x 20 µg | P36015 |
| pHrodo iFL Green Antibody Labeling Kit | 3 x 100 µg | P36022 |
| pHrodo iFL Green Antibody Labeling Kit | 3 x 1 mg | P36023 |
| 이름 | 라벨링 스케일 | 제품 번호 |
|---|---|---|
| SiteClick Antibody Azido Modification Kit (sDIBO label is not included order separately) | 100 mg | S20026 |
| Click-iT pHrodo iFL Red sDIBO Alkyne for Antibody Labeling | 100 mg | C20034 |
| SiteClick pHrodo Deep Red sDIBO Alkyne | 250 μg | S10914 |
| SiteClick pHrodo Deep Red sDIBO Alkyne | 1 mg | S10915 |
| SiteClick pHrodo iFL Red sDIBO Alkyne | 1 mg | S10903 |
| SiteClick pHrodo iFL Red sDIBO Alkyne | 5 mg | S10908 |
| 이름 | 라벨링 스케일 | 제품 번호 |
|---|---|---|
| Zenon pHrodo iFL Green Mouse IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25609 |
| Zenon pHrodo iFL Red Mouse IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25610 |
| Zenon pHrodo iFL Green Human IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25611 |
| Zenon pHrodo iFL Red Human IgG Labeling Reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25612 |
| Zenon pHrodo iFL Green Human IgG Labeling Reagent 5x | 최대 20개의 96 웰 플레이트 | Z25613 |
| Zenon pHrodo iFL Red Human IgG Labeling Reagent 5x | 최대 20개의 96 웰 플레이트 | Z25614 |
| Zenon pHrodo iFL Deep Red Mouse IgG Labeling reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25622 |
| Zenon pHrodo iFL Deep Red Human IgG Labeling reagent | 최대 4개의 96 웰 플레이트 | Z25618 |
| 이름 | 라벨링 스케일 | 제품 번호 |
|---|---|---|
| pHrodo Deep Red Antibody Labeling Kit | 3 x 100 µg | P35355 |
| pHrodo Deep Red Antibody Labeling Kit | 3 x 1 mg | P35356 |
| pHrodo iFL Red Microscale Protein Labeling Kit | 3 x 20 µg | P36014 |
| pHrodo iFL Red Antibody Labeling Kit | 3 x 100 µg | P36020 |
| pHrodo iFL Red Antibody Labeling Kit | 3 x 1 mg | P36021 |
| pHrodo iFL Green Microscale Protein Labeling Kit | 3 x 20 µg | P36015 |
| pHrodo iFL Green Antibody Labeling Kit | 3 x 100 µg | P36022 |
| pHrodo iFL Green Antibody Labeling Kit | 3 x 1 mg | P36023 |
LysoLight dye 기반 시약 및 키트를 사용한 분해 어세이
Invitrogen LysoLight 항체 라벨링 키트 및 반응성 염료는 항체, 단백질 또는 항체-약물 콘주게이트(ADC)의 이화적 리소좀 분해를 모니터링하는 강력한 도구입니다. pH-경사에 의존하는 pHrodo 기술과 달리 LysoLight 콘주게이트 항체 또는 단백질은 후기 엔도솜에서도 비형광성을 유지합니다. LysoLight dye는 리소좀에 대한 프로테아제가 풍부한 환경에 도달하면 단백질 분해를 나타내는 고유한 형광을 나타냅니다.
이 메커니즘은 단백질 또는 ADC의 내재화 및 이동을 이해하기 위한 뛰어난 감도와 특이성을 제공합니다. LysoLight 기술을 사용하여, 연구자들은 이화적 또는 재활용 경로를 향한 표적 단백질 분해제 후보물질의 성향을 평가할 수도 있습니다. 이를 통해 표적 단백질 분해 분야 연구자들은 최대의 잠재력을 가진 치료제 후보 물질을 알아낼 수 있습니다. LysoLight 키트 및 시약은 유세포분석, high content imaging, IncuCyte® Live-Cell Analysis System과 같은 광범위한 플랫폼과 호환됩니다.
자세히 알아보시려면 단백질 분해 메커니즘에 대한 기사를 읽어 보세요.
LysoLight Deep Red는 표적 단백질의 리소좀 분해를 직접 모니터링하도록 설계된 우수한 센서입니다. 분할되지 않은 형태에서 LysoLight Deep Red는 백그라운드 형광을 가지고 있지 않습니다. 리소좀 국소화된 프로테아제, 카테프신 B에 의한 분할이 있을 때만 염료는 형광이 되어 Cy5 채널에서 밝은 형광을 나타냅니다. 이 센서는 SDP 에스테르가 포함되어 있어 항체 또는 기타 관심 단백질의 라이신 잔기와 결합되어 단백질 분해를 효과적으로 모니터링할 수 있습니다.
LysoLight dye 기반 항체 라벨링 키트 및 시약 주문 정보
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