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제한효소 분해 및 DNA 변형
제한효소 분해 및 접합을 사용한 클로닝은 이중 가닥 DNA 단편을 한 플라스미드에서 다른 플라스미드로 이동시키기 위한 단순하고 쉬운 방법입니다.
시작 방법:
- 인식 서열이 관심 유전자의 옆에 오는 제한효소 선택
- 권장되는 시간 동안 반응 유도
- 단편 정제
- 관심 플라스미드 접합
Invitrogen Anza 제한 효소 클로닝 시스템
매우 간단한 클로닝을 위해 제한 효소 및 DNA 변형 효소로 구성된 완벽한 시스템입니다.
- 모든 제한 효소에 하나의 버퍼 사용
- 모든 DNA 유형에 대해 하나의 분해 프로토콜 사용
- 15분 이내에 완전 분해
- Star 활성 없는 야간 분해
제한 효소
반응에 사용되는 제한 효소 수나, 사용하고 있는 DNA 유형에 관계없이 간단한 2단계 프로토콜이 적용됩니다. 반응 혼합물을 준비하여 37°C에서 15분 동안 인큐베이션하면 됩니다.
Anza 버퍼(Buffer)
기존 제한 효소
제한 효소(RE)는 특정 4 또는 8염기쌍 역반복(inverted repeat) 인식서열에서 이중 가닥 DNA를 절단하는 작용을 합니다. DNA 분할 산물은 평활 말단(blunt-ended)을 가지거나 5′ 또는 3′ 돌출부가 있습니다.
DNA 변형 효소
리가아제(Ligase)
제한 효소 분해에 의해 생성되는 말단의 유형과 관계없이 DNA 분할로 말단에 3′-하이드록실기 및 5′-포스페이트기를 가진 단편이 생성됩니다. DNA 리가아제는 ATP 의존 반응에서 이중 DNA(또는 RNA)의 5′-포스페이트 및 3′-하이드록실 말단을 공유 결합으로 연결시킵니다.
알카라인 포스파타아제
알카라인 포스파타아제는 DNA와 RNA의 3′ 및 5′ 인산을 가수 분해합니다. 이는 말단 라벨링 전에 5′ 인산을 제거하고 삽입체 접합 전에 벡터를 인산을 제거하는 데 적합합니다. 또한 단백질의 인산을 제거하는데 사용할 수도 있습니다.
말단 복원
말단을 복원하면 5′ 또는 3′ 돌출부가 있는 DNA를 5′ 인산화 평활 말단 DNA로 변환하여 평활 말단 클로닝 벡터에 효율적으로 접합할 수 있습니다.
폴리뉴클레오티드 키나아제
폴리뉴클레오티드 키나아제는 DNA와 올리고핵산염의 5’-인산화를 수행하는 데 사용합니다. 클로닝의 접합 단계를 위해 DNA를 전처리할 때 삽입 DNA 또는 벡터 DNA 중 하나에 5’ 인산이 포함되어야 합니다. 종종 PCR-증폭 DNA를 후속 클로닝 접합을 위해 T4 PNK로 처리하여 5’ 말단을 인산화합니다.
DNA 평활화(blunting)
DNA 평활화 키트를 통해 점착성 말단을 가진 DNA를 평활 말단(blunt-end) DNA로 변환하여 평활 말단 접합 반응에 사용할 수 있습니다. 이 키트는 원하는 벡터에 평활 말단이 만들어질 인식 부위가 없는 경우 유용합니다.
중합효소(polymerase)
중합효소는 평활 말단을 만들거나 라벨링된 DNA를 결합하는 데 사용됩니다.