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유전자 발현 분석
TaqMan 검출 방법은 일반적으로 더 짧은 프로토콜, 더 높은 특이성 및 민감도와 복합 분석 기능을 제공합니다. SYBR Green 염료 기반 방법은 종종 사용할 수 있는 프라이머 범위의 관점에서 보다 유연한 것으로 간주되며 비용은 일반적으로 저렴합니다.
Fast Advanced Cells-to-CT kit | Cells-to-CT kit | |||
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하나의 완벽한 워크플로우 | Lysis → RT → qPCR | |||
Cells-to-CT Lysis, DNase 및 Stop Solutions | 예 | |||
Detection chemistry | SYBR Green format* | TaqMan format** | SYBR Green format* | TaqMan format** |
결과를 얻기까지 소요 시간 | 95분 | 80분 | 120분 | |
Working range | 10–100,000개 세포 | 10–100,000개 세포 | ||
특이성 | 보통† | 높음 | 보통† | 높음 |
민감도(qPCR reaction으로 만드는 샘플의 최대 백분율) | 13.5% lysate | 20% lysate | 20% lysate | 20% lysate |
재현성 | 보통† | 높음 | 보통† | 높음 |
Multiplexing | ||||
Predesigned assays | ||||
일반적으로 사용자 디자인, 실험 최적화 필요 | ||||
유전자 발현 | 중간 수준의 정량 | 높은 수준의 정량 | 중간 수준의 정량 | 높은 수준의 정량 |
애플리케이션 |
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검출 |
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* SYBR Green 기반 검출은 SYBR Green 염료를 사용하여 PCR 동안 축적되는 PCR 산물을 검출합니다.
** TaqMan 기반 검출은 PCR 동안 축적되는 표적 유전자에 특이적인 형광 프로브를 사용하여 표적 유전자를 검출합니다.
† SYBR Green 기반 어세이에서는 특이성을 보장하기 위해 프라이머를 설계하고 검증해야 합니다. 특이성과 재현성은 template quality 과 프라이머 디자인 및 최적화에 달려 있습니다.
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Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit | Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green Kit | |
1단계 qPCR 샘플 전처리 | 1단계 qPCR 샘플 전처리 | |
Detection chemistry | TaqMan | SYBR Green |
특이성 | 높음 | 보통* |
lysis 단계에서 세포 개수 | 10–100,000개 세포 | 10–100,000개 세포 |
검출 민감도 | 1–10 copies | 가변적* |
재현성 | 높음 | 보통* |
RNA 정제 필요 | 아니오 | 아니오 |
8개 샘플에 대한 샘플 전처리 시간(qRT-PCR까지) | 7분 | 7분 |
총 시간(cell lysis 부터 qRT-PCR 결과까지) | 35분 | 1시간 23분 |
Multiplexing | ||
cDNA 보관 | ||
RT enzyme 및 master mix 포함 | ||
preamplification 시약 포함 | ||
자동화에 적합 | ||
유연성 | 보통 | 보통 |
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단일 Cell-to-CT qRT-PCR Kit | |
단일 Cell-to-CT Kit | |
Detection chemistry | TaqMan |
특이성 | 높음 |
lysis 단계에서 세포 개수 | 1-10개 세포 |
검출 민감도 | 1-10개 copies |
재현성 | 높음 |
RNA 정제 필요 | 아니오 |
8개 샘플에 대한 샘플 전처리 시간(qRT-PCR까지) | 7분 |
총 시간(cell lysis부터 qRT-PCR 결과까지) | 3시간 |
Multiplexing | |
cDNA 보관 | |
RT enzyme 및 master mix 포함 | |
preamplification 시약 포함 | |
자동화에 적합 | |
유연성 | 높음 |
* template quality 및 프라이머/디자인 최적화에 따라 다릅니다.
Fast Advanced Cells-to-CT kit | Cells-to-CT kit | |||
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하나의 완벽한 워크플로우 | Lysis → RT → qPCR | |||
Cells-to-CT Lysis, DNase 및 Stop Solutions | 예 | |||
Detection chemistry | SYBR Green format* | TaqMan format** | SYBR Green format* | TaqMan format** |
결과를 얻기까지 소요 시간 | 95분 | 80분 | 120분 | |
Working range | 10–100,000개 세포 | 10–100,000개 세포 | ||
특이성 | 보통† | 높음 | 보통† | 높음 |
민감도(qPCR reaction으로 만드는 샘플의 최대 백분율) | 13.5% lysate | 20% lysate | 20% lysate | 20% lysate |
재현성 | 보통† | 높음 | 보통† | 높음 |
Multiplexing | ||||
Predesigned assays | ||||
일반적으로 사용자 디자인, 실험 최적화 필요 | ||||
유전자 발현 | 중간 수준의 정량 | 높은 수준의 정량 | 중간 수준의 정량 | 높은 수준의 정량 |
애플리케이션 |
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검출 |
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* SYBR Green 기반 검출은 SYBR Green 염료를 사용하여 PCR 동안 축적되는 PCR 산물을 검출합니다.
** TaqMan 기반 검출은 PCR 동안 축적되는 표적 유전자에 특이적인 형광 프로브를 사용하여 표적 유전자를 검출합니다.
† SYBR Green 기반 어세이에서는 특이성을 보장하기 위해 프라이머를 설계하고 검증해야 합니다. 특이성과 재현성은 template quality 과 프라이머 디자인 및 최적화에 달려 있습니다.
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Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit | Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green Kit | |
1단계 qPCR 샘플 전처리 | 1단계 qPCR 샘플 전처리 | |
Detection chemistry | TaqMan | SYBR Green |
특이성 | 높음 | 보통* |
lysis 단계에서 세포 개수 | 10–100,000개 세포 | 10–100,000개 세포 |
검출 민감도 | 1–10 copies | 가변적* |
재현성 | 높음 | 보통* |
RNA 정제 필요 | 아니오 | 아니오 |
8개 샘플에 대한 샘플 전처리 시간(qRT-PCR까지) | 7분 | 7분 |
총 시간(cell lysis 부터 qRT-PCR 결과까지) | 35분 | 1시간 23분 |
Multiplexing | ||
cDNA 보관 | ||
RT enzyme 및 master mix 포함 | ||
preamplification 시약 포함 | ||
자동화에 적합 | ||
유연성 | 보통 | 보통 |
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단일 Cell-to-CT qRT-PCR Kit | |
단일 Cell-to-CT Kit | |
Detection chemistry | TaqMan |
특이성 | 높음 |
lysis 단계에서 세포 개수 | 1-10개 세포 |
검출 민감도 | 1-10개 copies |
재현성 | 높음 |
RNA 정제 필요 | 아니오 |
8개 샘플에 대한 샘플 전처리 시간(qRT-PCR까지) | 7분 |
총 시간(cell lysis부터 qRT-PCR 결과까지) | 3시간 |
Multiplexing | |
cDNA 보관 | |
RT enzyme 및 master mix 포함 | |
preamplification 시약 포함 | |
자동화에 적합 | |
유연성 | 높음 |
* template quality 및 프라이머/디자인 최적화에 따라 다릅니다.
새로운 Invitrogen Fast Advanced Cells-to-CT kit는 배양된 세포 샘플에서 real-time RT-PCR(RT-qPCR)에 의한 상대적인 유전자 발현 측정에 이르기까지 RNA 정제를 완전히 건너뛸 수 있는 기능을 연구자에게 제공합니다. 유연성을 위해 Cells-to-CT kits는 TaqMan 및 SYBR Green 형식으로 제공됩니다. 이 키트들은 RNA 정제 없이 배양 세포에서 직접 RT-qPCR 분석을 위한 완벽한 워크플로우를 제공합니다. genomic DNA(gDNA)를 제거하고 RNA integrity 을 보존하면서 배양된 세포를 용해하는 고유의 방법을 특징으로 하는 이 키트에는 cDNA 합성을 위한 역전사(RT) 시약과 real-time PCR 분석을 위한 TaqMan 또는 SYBR Green master mixes가 들어 있습니다.
새로운 TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT Kit는 풍부하거나 희귀한 transcripts를 감지하는데 더 민감한 개선된 역전사 효소를 활용합니다. 이를 통해 RNA 정제 없이 배양된 세포로부터 직접 발현 분석을 수행할 수 있습니다. 이 키트는 시간을 절약하고 몇 가지 샘플에 적합한 간단한 워크플로우를 제공하지만 자동화된 high-throughput 애플리케이션에 쉽게 통합할 수도 있습니다.
새로운 SYBR Green Fast Advanced Cells-to-CT Kit는 배양된 세포에서 실시간 PCR 결과로 직접 이동할 수 있는 빠르고 간편하고 강력한 방법입니다. 이 입증된 cell lysis 및 RNA stabilization 기술은 인력과 시간이 많이 소요되는 RNA purification 과정을 완전히 제거합니다. 이 키트는 표준 실시간 PCR로 최고 수준의 특이성을 제공하는 Applied Biosystems AmpliTaq Gold DNA Polymerase, LD(Low DNA)로 구동됩니다.
Cells-to-CT Stop Solution을 사용하면 다운스트림 RT 및 qPCR 반응에 더 많은 샘플을 주입할 수 있어 희귀 표적을 탐지하는 감도가 크게 향상됩니다. TaqMan 및 SYBR Green Fast Advanced Cells-to-CT Kit는 모두 Stop Solution을 사용하여 매우 빠른 워크플로우로 탁월한 감도를 제공합니다. 이 키트는 대부분의 high-throughput RNA purification 키트보다 약 48배 빠릅니다. Fast Advanced Cells-to-CT kit는 96개 또는 384개의 well을 한 번에 처리할 수 있습니다. 실험 워크플로우는 96-well 또는 384-well plate에 약 10분이 소요됩니다. 다른 공급업체의 제품은 워크플로우에서 낮은 pH 및 희석액을 사용하므로 다운스트림 단계에서 사용할 수 있는 cell lysate 의 양이 제한됩니다.
그림 1. 워크플로우의 각 단계에서 lysate 또는 RT reaction 의 양. Real-time ready kits는 현재 당사 Cells-to-CT 포트폴리오의 주력 제품입니다.
그림 2. Fast Advanced Cells-to-CT kit의 절차는 역전사 및 cell lysis 후 qPCR을 포함하는 2단계 과정입니다. 1단계 반응은 RT 및 qPCR이 single well 에서 수행되는 것입니다. qPCR 단계에서 TaqMan Assays 는 각 타겟에 맞게 설계된 맞춤형 프라이머 및 프로브 조합을 사용합니다. 이 어세이들은 일반적인 qPCR 프라이머를 사용하는 SYBR Green 분석보다 더 민감하고 특이적입니다.
Cells-to-CT kits는 RNA 정제 없이 배양 세포에서 real-time qRT-PCR 분석을 위한 완벽한 워크플로우를 제공합니다. genomic DNA(gDNA)를 제거하고 RNA integrity를 보존하면서 배양된 세포를 용해하는 고유의 방법을 특징으로 하는 이 키트에는 cDNA 합성을 위한 역전사(RT) 시약과 실시간 PCR 분석을 위한 probe-based (TaqMan probes) 또는 dye-based (SYBR Green dye) master mixes가 들어 있습니다.
1단계 키트와 2단계 키트는 1단계 키트가 역전사와 real-time PCR을 단일 단계로 결합하여 피펫팅 단계와 프로토콜 시간을 크게 줄인다는 점에서 다릅니다.
플레이트 또는 튜브를 사용하는지에 관계없이 Cells-to-CT 키트는 아래에 요약된 간단한 7-8분의 샘플 전처리 절차를 사용합니다(그림 2). lysis technology는 시료당 10 –100,000 개의 배양 세포를 위해 설계되었습니다. 세포를 PBS에서 세척해 실온에서 5분간 용해합니다. DNase 처리를 동시에 실시할 수 있습니다. Stop Solution과 함께 2분간 배양하여 실온에서 용해를 종결합니다. 용해물은 이제 real-time PCR 장비에서 분석할 준비가 되었습니다. 또는 –20°C에서 최대 5개월간 보관할 수 있습니다. 2단계 키트 워크플로우는 역전사를 진행하여 cDNA를 합성한 후 cDNA 샘플을 보관하거나 real-time qPCR로 직접 분석할 수 있습니다.
Culture well (96-well 또는 384-well)에서 직접 샘플을 처리할 수 있기 때문에 샘플 취급 및 샘플 손실 또는 전달 오류 가능성이 최소화되어 신속한 high-throughput 처리가 용이합니다. 기존 여러 단계의 RNA isolation 프로토콜과 달리 heating, washing 또는 원심분리 단계가 필요하지 않습니다. 이 키트는 인력이 소요되는 30-60분 공정을 크게 단순화하고 반응 시간을 7-8분으로 단축하여 샘플에서 qRT-PCR 반응까지 35분만에 완벽한 세포 배양 공정을 완료할 수 있도록 합니다(예: Cells-to-CT 1단계 TaqMan 키트).
Fast Advanced Cells-to-CT 2-step kit는 민감도 저하 없이 기존 RNA purification 보다 빠르고 사용이 간편합니다. 이 워크플로우는 용해물 기반이므로 Cells-to-CT 키트 사용으로 RNA가 손실되지 않습니다. 전통적인 RNA purification 에서는 필터 또는 마그네틱 비드에서 불완전한 elution 으로 소량의 RNA가 항상 손실됩니다. 따라서 주입량이 적은 세포 샘플(10-1,000)에서 희귀 RNA를 검출하는 능력은 RNA 정제 워크플로우를 사용하는 샘플의 결과와 비교하여 Cells-to-CT 키트로 샘플을 처리할 때 더 높습니다. 이러한 장점은 Stop Solution의 장점과 함께 풍부하거나 Stop Solution 모두에 대하여 Cells-to-CT 워크플로우가 경쟁사 키트보다 감도가 높은 이유입니다.
그림 3. 다른 키트와 비교한 민감도. 각 키트의 프로토콜에 따라 104개의 세포를 용해시켰습니다. 최대량의 용해물을 각 키트의 RT에 추가했습니다(Cells-to-CT 및 Fast Advanced Cells-to-CT kit의 경우 45%, 다른 공급업체의 경우 10%). 그런 다음 각 키트의 qPCR master mix 를 사용하여 phosphodiesterases에 대한 TaqMan Array 의 qPCR 반응에 25%의 RT를 첨가하였습니다. Fast Advanced Cells-to-CT kit는 원래 Cells-to-CT 키트보다 평균 0.5Ct 더 우수하고 다른 공급업체 키트보다 3.6Ct 더 우수한 것으로 나타났습니다(다른 공급업체보다 11배 더 민감함).
그림 4. 다른 키트와 비교한 감도. 각 키트의 프로토콜에 따라 104개의 세포를 용해시켰습니다. 최대량의 용해물을 각 키트의 RT에 추가했습니다(원래 Cells-to-CT 키트 및 Fast Advanced Cells-to-CT kit의 경우 45%, 다른 공급업체 키트의 경우 10%). 그런 다음 각 키트의 qPCR master mix 를 사용하여 phosphodiesterases에 대한 TaqMan Array 의 qPCR 반응에 25%의 RT를 첨가하였습니다. 결론: Fast Advanced Cells-to-CT kit는 원래 Cells-to-CT 키트보다 평균 0.7Ct 더 우수하고 다른 공급업체 키트보다 4.7Ct 더 우수한 것으로 나타났습니다. 이는 Fast Advanced 키트가 다른 공급업체의 키트보다 14배 더 민감하다는 것을 의미합니다.
그림 5. 검출 비교. 각 키트의 프로토콜에 따라 104 HepG2 세포를 용해시켰습니다. 최대량의 용해물을 각 키트의 RT에 추가했습니다(Cells-to-CT 및 Fast Advanced Cells-to-CT kit의 경우 45%, 다른 공급업체의 경우 10%). 그런 다음 25%의 RT를 다른 공급업체 키트에 대한 qPCR reactions에 추가하고, 30%는 Fast Advanced Cells-to-CT kit에 대한 qPCR 반응에, 45%는 Power SYBR 키트에 추가하였습니다. 10개의 각기 다른 유전자를 분석했습니다. 이 세포주에서 대부분의 유전자가 검출되지 않았습니다. 검출된 유전자의 경우 Fast Advanced Cells-to-CT kit는 대부분의 유전자에 대하여 다른 키트보다 Ct 값이 낮습니다.
Fast Advanced Cells-to-CT kit에는 96 또는 384개의 샘플을 10분 이내에 완료할 수 있는 샘플 전처리 단계가 포함되어 있습니다. 마그네틱 비드 키트와 같은 High throughput RNA 분리 방법은 384개의 샘플을 처리할 수 있지만 프로토콜 시간은 3시간입니다*. 일반적인 drug target validation screen 에서 다수의 96 또는 384-well plate가 처리된다는 점을 고려하여 1536개의 샘플(즉, 4 x 384 plate 또는 16 X 96-well plate)를 전처리하는데 필요한 시간을 비교했습니다.
* MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit의 프로토콜 지속 시간 기준
Cells-to-CT 키트의 모든 구성 요소는 일관되고 안정적인 성능을 위해 최적화되었습니다. 이를 통해 샘플 전처리 및 real-time RT-PCR 마스터 믹스 조립과 관련하여 추측의 위험이 최소화됩니다.
추가적인 품질 보증을 위해 Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit는 TaqMan Gene Expression Assays로 검증되었으며 Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green Kit는 일련의 공통 유전자 표적 프라이머로 검증되었습니다. 둘 다 정제된 RNA로 얻은 성능과 동등한 성능을 나타냅니다(그림 6).
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit의 성능을 다른 상용 lysis 키트 및 정제된 RNA와 비교하였습니다. 용해 반응당 100–100,000개의 세포 주입을 검사하였습니다. TaqMan Cells-to-CT Kit 프로토콜의 민감도는 정제된 RNA에서 획득한 민감도와 유사하였으며 다른 공급업체의 제품보다 우수했습니다(그림 7).
그림 6. Cells-to-CT 키트를 사용한 제한된 표적 염기 서열의 감도 및 검출.(A) lysate 및 정제된 RNA를 이용한 gene expression assays의 민감도. HeLa 세포(10-100,000)를 Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit를 사용하여 3회 처리하거나 RNA를 RNA spin column 방법을 사용하여 정제하였습니다. Cells-to-CT Control Kit의 XENO 및 ACTB에 대해 7900HT Real-Time PCR System에서 real-time RT-PCR로 각 샘플 세트를 분석했습니다. (B) 제한된 표적 서열의 검출. 증가하는 양의 NIH3T3 세포(mouse)를 10,000 HeLa 세포에 첨가하였습니다. TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit(2 단계 절차)를 사용하여 세포를 3회 처리하거나 RNA spin column 방법으로 정제된 시약을 사용하였습니다. 7900HT Fast Real-Time PCR System에서의 3회 반응에서 모든 샘플을 마우스 특이적(B2M) 및 인간 특이적(TKT) 유전자에 대하여 역전사 시켰습니다.
그림 7. Cells-to-CT 키트를 사용하여 생성된 용해물로 TaqMan Gene Expression Assays에서 우수한 감도를 얻었습니다. HeLa 세포(100-100,000)는 전통적인 RNA 정제, TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit, 또는 공급업체 Q 및 S의 다른 용해물 방법을 사용하여 제조되었습니다. 역전사 반응은 각 키트에 대해 최대 권장 샘플 주입량으로 수행되었습니다. real-time PCR을 PPIA TaqMan Gene Expression Assay를 사용하여 3회 수행하였습니다.
다양한 응용 분야에서 최적화된 결과를 경험할 수 있도록 real-time PCR 기기 솔루션을 제공하여 실험 워크플로우를 완료합니다. real-time PCR은 핵산 표적을 높은 감도로 특이적으로 검출하고 정량 분석하는데 사용됩니다. 당사는 강력한 assay 디자인 알고리즘, 최적화된 master mixes, 직관적인 데이터 분석 소프트웨어와 유연한 기기 장치 등을 개발하여 다양한 각종 응용 분야에 걸쳐 qPCR의 능력을 활용하는 데 도움이 되도록 하였습니다. 여러분의 qPCR 기반 연구에 적합한 솔루션을 찾아보십시오.
The TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit has performed consistently. The performance is increased as compared to RNA purification, RT steps, and then qRT-PCR. There is less handling, less chance at mistakes. Because of this time savings and increase in sensitivity, I’ve incorporated this protocol into the Human Embryonic Stem Cell Training Course at the Stem Cell Research Center at Rutgers University. | ||
—Director, Stem Cell Core Facility | ||
Gene expression quantification on cultured cells using the reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) typically involves an RNA purification step that limits sample processing throughput and precludes parallel analysis of large numbers of samples. An approach in which cDNA synthesis is carried out on crude cell lysates instead of on purified RNA samples can offer a fast and straightforward alternative. Here, we evaluate such an approach, benchmarking the Ambion Cells-to-CT kit with the classic workflow of RNA purification and cDNA synthesis, and demonstrate its good accuracy and superior sensitivity. | ||
This ASCB presentation shows you how Invitrogen Cells-to-CT Kits allow you to measure relative gene expression by real-time RT-PCR without having to purify RNA prior to amplification.
Learn how to prepare RNA for gene expression analysis from cultured cells in 7 minutes.
You get real-time PCR results in less time with the Invitrogen Cells-to-CT Kits. It is fast, easy and robust. Fewer handling steps ensure shorter protocol time, increased consistency, minimal sample loss and a reduced risk for contamination.
Nucleic Acid Purification and Analysis Support Center
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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.