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Invitrogen Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 hot-start, 엔지니어링된 교정(proofreading) DNA 중합효소로서 탁월한 PCR 정확도(fidelity)와 특이도를 제공합니다. Taq 정확도(fidelity)의 300x를 초과하는 정확도를 가지며 60°C에서의 프라이머 어닐링(primer annealing)을 위해 특별히 제조된 완충액이 포함된 Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 클로닝(cloning), 염기서열분석(sequencing), 돌연변이 유발(mutagenesis)과 같이 최고의 PCR 정확도가 요구되는 PCR 애플리케이션에서 효율성과 간단성을 제공합니다.
Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 오류율을 매우 낮게 유지하고 DNA 염기서열 정확도를 보존하기 위해 최고 수준의 신뢰도를 제공합니다. Platinum SuperFi II DNA 중합효소의 상대 정확도(fidelity)는 Taq DNA 중합효소 정확도(fidelity)의 300배를 초과하는 것으로 계산되었습니다.
그림 1. Taq 효소와 상업적으로 이용가능한 효소들의 정확도(fidelity) 상대 비교. 3.9 kb 염기서열을 다른 DNA 중합효소를 사용하여 PCR 증폭하였으며, 그다음 결과물인 PCR 앰플리콘을 MuA transposase를 사용하여 단편화하였습니다. 무작위 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 Unique molecular identifiers (UMI)가 단편화 중에 도입되어 각각의 산물이 개별적으로 태그(tag) 되었습니다. 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing) 후, 리드(read)는 올바른 서열에 따라 정렬되었고, UMI 패밀리에 의해 그룹화되었으며, 오류는 콜(call) 되었습니다. 오류는 UMI 패밀리에 있는 모든 리드(read)에서 나타나는 경우에만 규명하였고, 그외에는 염기서열분석 오류로서 폐기하였습니다. 중합효소 정확도(fidelity)는 Taq DNA 중합효소에 대해 정규화되었습니다.
특별한 조성의 Platinum SuperFi II 완충액은 PCR 중의 힘들고 지루한 최적화 단계를 감소시키는데 도움을 줍니다. Platinum SuperFi II DNA 중합효소의 경우, 어닐링(annealing) 단계를 위한 프라이머 용융(melting) 온도 계산이 필요없습니다. 혁신적인 완충액 조성으로 일반적인 프라이머 설계 규칙을 따르는 염기서열에 상관없이 60°C에서 프라이머의 어닐링이 가능합니다 (그림 2). 또한 계산된 Tm을 어닐링 단계에서 사용하는 경우, 완충액은 성공적인 증폭을 가능하게 합니다 (데이터 표시되지 않음).
그림 2.Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 60°C에서 일반적인 어닐링 온도를 사용하여 DNA 템플릿을 증폭하는 경우 높은 특이도와 수율을 가진 PCR 산물을 생산합니다. 다양한 어닐링 온도의 프라이머 세트가 60°C 어닐링 온도에서 50 ng의 인간 유전체 DNA로부터 12개 타겟을 증폭하는데 사용되었습니다. 분자량 마커는 Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다. 명시된 어닐링 온도는 Platinum SuperFi DNA 중합효소를 위해 Tm 계산기를 사용하여 계산되었습니다.
혁신적인 반응 완충액으로 인해 Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 범용 어닐링 온도 및 모든 어세이의 co-cycling을 위한 유연한 확장 시간을 제공합니다.
그림 4. Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 짧거나 긴 앰플리콘을 함께 사이클링할 수 있습니다. 4개 타겟 모두 같은 프로토콜을 사용하여, 0.7 kb, 2.0 kb, 4.8 kb, 14 kb 단편들이 100 ng의 인간 유전체 DNA로부터 증폭되었습니다. 98°C 변성(denaturation) 10초, 60°C 어닐링(annealing) 10초, 72°C 확장(extension) 7분. 확장 시간은 가장 긴 길이의 타겟에 근거하였습니다.
Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix는 PCR 산물의 직접 gel 로딩을 가능하게 하여 편리하며, PCR 샘플에 염료를 첨가하는 힘들고 지루한 단계가 필요 없으며, 피펫팅 오류를 감소시키는데 도움을 줍니다. 녹색 완충액은 DNA 염기서열분석(sequencing), ligation 및 restriction 분해 등 다운스트림 애플리케이션과 호환가능합니다.
Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 오류율을 매우 낮게 유지하고 DNA 염기서열 정확도를 보존하기 위해 최고 수준의 신뢰도를 제공합니다. Platinum SuperFi II DNA 중합효소의 상대 정확도(fidelity)는 Taq DNA 중합효소 정확도(fidelity)의 300배를 초과하는 것으로 계산되었습니다.
그림 1. Taq 효소와 상업적으로 이용가능한 효소들의 정확도(fidelity) 상대 비교. 3.9 kb 염기서열을 다른 DNA 중합효소를 사용하여 PCR 증폭하였으며, 그다음 결과물인 PCR 앰플리콘을 MuA transposase를 사용하여 단편화하였습니다. 무작위 12개의 뉴클레오티드로 이루어진 Unique molecular identifiers (UMI)가 단편화 중에 도입되어 각각의 산물이 개별적으로 태그(tag) 되었습니다. 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing) 후, 리드(read)는 올바른 서열에 따라 정렬되었고, UMI 패밀리에 의해 그룹화되었으며, 오류는 콜(call) 되었습니다. 오류는 UMI 패밀리에 있는 모든 리드(read)에서 나타나는 경우에만 규명하였고, 그외에는 염기서열분석 오류로서 폐기하였습니다. 중합효소 정확도(fidelity)는 Taq DNA 중합효소에 대해 정규화되었습니다.
특별한 조성의 Platinum SuperFi II 완충액은 PCR 중의 힘들고 지루한 최적화 단계를 감소시키는데 도움을 줍니다. Platinum SuperFi II DNA 중합효소의 경우, 어닐링(annealing) 단계를 위한 프라이머 용융(melting) 온도 계산이 필요없습니다. 혁신적인 완충액 조성으로 일반적인 프라이머 설계 규칙을 따르는 염기서열에 상관없이 60°C에서 프라이머의 어닐링이 가능합니다 (그림 2). 또한 계산된 Tm을 어닐링 단계에서 사용하는 경우, 완충액은 성공적인 증폭을 가능하게 합니다 (데이터 표시되지 않음).
그림 2.Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 60°C에서 일반적인 어닐링 온도를 사용하여 DNA 템플릿을 증폭하는 경우 높은 특이도와 수율을 가진 PCR 산물을 생산합니다. 다양한 어닐링 온도의 프라이머 세트가 60°C 어닐링 온도에서 50 ng의 인간 유전체 DNA로부터 12개 타겟을 증폭하는데 사용되었습니다. 분자량 마커는 Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다. 명시된 어닐링 온도는 Platinum SuperFi DNA 중합효소를 위해 Tm 계산기를 사용하여 계산되었습니다.
혁신적인 반응 완충액으로 인해 Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 범용 어닐링 온도 및 모든 어세이의 co-cycling을 위한 유연한 확장 시간을 제공합니다.
그림 4. Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 짧거나 긴 앰플리콘을 함께 사이클링할 수 있습니다. 4개 타겟 모두 같은 프로토콜을 사용하여, 0.7 kb, 2.0 kb, 4.8 kb, 14 kb 단편들이 100 ng의 인간 유전체 DNA로부터 증폭되었습니다. 98°C 변성(denaturation) 10초, 60°C 어닐링(annealing) 10초, 72°C 확장(extension) 7분. 확장 시간은 가장 긴 길이의 타겟에 근거하였습니다.
Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix는 PCR 산물의 직접 gel 로딩을 가능하게 하여 편리하며, PCR 샘플에 염료를 첨가하는 힘들고 지루한 단계가 필요 없으며, 피펫팅 오류를 감소시키는데 도움을 줍니다. 녹색 완충액은 DNA 염기서열분석(sequencing), ligation 및 restriction 분해 등 다운스트림 애플리케이션과 호환가능합니다.
Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 효소의 강력성과 우수한 hot-start 기술 덕분에 높은 특이도와 수율로 다양한 길이의 타겟을 증폭합니다. 항체-기반의 Platinum hot-start 기술은 타겟 앰플리콘의 더 큰 수율을 나타내며 비특이적 증폭과 프라이머 분해를 방지하면서 초기 PCR 변성 단계까지 효소 활성을 저해합니다.
그림 6. 광범위한 앰플리콘 길이에 걸친 활용성. Platinum SuperFi II DNA 중합효소 (가장 왼쪽 패널)은 높은 특이도와 수율로 100 ng의 인간 유전체 DNA로부터 0.3 에서 14 kb 까지 다양한 크기의 DNA 단편을 증폭합니다. 또한 같은 타겟을 경쟁사 DNA 중합효소를 사용하여 증폭하였습니다. A—Merck KOD Hot Start, B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit, C—PrimeSTAR GXL. 분자량 마커는 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다.
Platinum SuperFi DNA 중합효소는 감도가 높으므로 적은 양의 DNA 템플릿 검출이 가능하며 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. 시작 물질 양이 적거나 타겟 DNA가 샘플에 저농도로 존재하는 실험에서 감도가 높으면 유용합니다.
그림 7. 적은 양의 주입 DNA로부터 높은 민감도와 신뢰도로 증폭. Platinum SuperFi II DNA 중합효소(가장 왼쪽 패널)은 0.4 ng, 2 ng, 10 ng, 50ng, 250ng의 인간 유전체 DNA로부터 2 kb 단편의 신뢰할 수 있는 증폭을 보여줍니다 (템플릿 양은 각 줄의 위에 표시). 같은 타겟을 경쟁사의 DNA 중합효소로 증폭하였습니다: A—PfuUltra II Fusion Hot Start, B—HotStar HiFidelity DNA Polymerase Kit, C—Expand HiFiPLUS Enzyme Blend. 추정 복제 수(estimated copy number)는 인간 유전체 DNA 0.4 ng당 ~100개 복제(copy)입니다. 분자량 마커는 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다.
Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 DNA-결합 도메인으로 엔지니어링되어 high processivity를 나타내며 hemin(적혈구 세포 구성요소), xylan(식물성 바이오고분자), humic acid(토양에서 발견)과 같은 일반적인 PCR 억제제에 대해 증가된 내성을 나타냅니다.
그림 8. Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 일반적인 PCR 억제제에 대해 강한 내성을 나타냅니다. 2 kb 인간 유전체 DNA 단편이 Platinum SuperFi II DNA 중합효소 또는 경쟁사 high-fidelity DNA 중합효소를 사용하여 50 ng의 인간 유전체 DNA로부터 증폭되었습니다: A—Q5 Hot Start High-Fidelity, B—PrimeSTAR GXL, C—Merck KOD Hot Start, D—KAPA HiFi HotStart PCR Kit. 1—no inhibitor, 2—humic acid (4 µg/mL), 3—hemin (20 µM), 4—bile salt (1 mg/mL)를 함유하는 반응 혼합물. 분자량 마커는 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다.
실온에서 Platinum SuperFi II DNA 중합효소의 안정성이 향상되어 고처리량 작업이 가능합니다. 탁월한 Platinum hot-start 기술로 인해 효소는 벤치탑 안정성과 높은 특이도를 나타냅니다.
그림 9. Platinum SuperFi II DNA 중합효소를 사용하여 형성된 반응들은 실온에서 안정합니다. 0.5 kb 단편은 50 ng의 인간 유전체 DNA로부터 증폭되었습니다. PCR 반응을 셋업하고 Applied Biosystems ProFlex thermal cycler에 로딩하기 전에 0hr 및 24hr 동안 실온에 방치하였습니다. 실온 셋업 24hr 후에도 Platinum SuperFi II DNA 중합효소(P 줄)는 높은 특이도와 수율을 나타냅니다. 또한 같은 실험을 경쟁사 DNA 중합효소로도 실시하였습니다: A—Q5 Hot Start High-Fidelity, B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit, C— PrimeSTAR GXL. 분자량 마커는 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다.
Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 효소의 강력성과 특별히 제조된 완충액으로 인해 높은 특이도로 다양한 함량의 염기서열을 증폭합니다. Platinum SuperFi II 완충액은 DNA 용융(melting) 첨가제의 보충없이 GC-rich 타겟의 증폭을 가능하게 합니다.
그림 10. Platinum SuperFi II DNA 중합효소에 의한 AT-rich 및 GC-rich 타겟의 강력한 증폭 다양한 GC 함량의 15개 타겟이 DNA 변성을 돕는 완충액 첨가제의 보충없이 50 ng의 인간 유전체 DNA로부터 증폭되었습니다. 분자량 마커는 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다.
그림 11. GC-rich 타겟의 증폭 향상. Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 DNA 용융(melting) 첨가제 없이 어려운 GC-rich 타겟(가장 왼쪽 패널)에 대해 높은 특이도 및 수율을 제공합니다. 4개의 GC-rich 단편(0.74 kb, 0.58 kb, 0.71 kb, 0.72 kb 길이; GC 함량은 위에 표기)이 50ng의 인간 유전체 DNA로부터 증폭되었습니다. 또한 GC-rich PCR을 위한 제조사의 권장 프로토콜에 따라, 같은 타겟을 경쟁사 DNA 중합효소를 사용하여 증폭하였습니다. A—PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit in specialized reaction buffer for GC rich fragments, C—Merck KOD Hot Start DNA Polymerase with 10% DMSO added. 분자량 마커는 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다.
Platinum SuperFi DNA 중합효소는 processivity가 높고 오류율이 매우 낮으므로 높은 수율과 특이도로 긴 단편(최대 20 kb)을 정확하게 증폭하는데 이상적입니다. 더 긴 타겟(최대 40 kb)의 증폭은 가능하지만 고-품질 템플릿(순수, 신선, 무변형)과 새 프라이머 용액 사용 등 추가적인 최적화가 필요할 수도 있습니다. 프라이머 농도를 0.2 μM로 감소시키는 것 역시 결과를 향상시킬 수 있습니다.
그림 12. 긴 단편 증폭. Platinum SuperFi II DNA 중합효소(P 줄)는 200 ng의 인간 유전체 DNA로부터 20 kb 타겟을 성공적으로 증폭합니다. 같은 프라이머 세트를 사용하여 경쟁사 DNA 중합효소도 테스트되었습니다: A—Q5 Hot Start High-Fidelity, B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit, C—Merck KOD Hot Start, E - D—PrimeSTAR GXL and E—PfuUltra II Fusion HotStart. 분자량 마커는 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder입니다.
높은 specificity와 processivity를 가진 Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 특별한 최적화없이, 제공되는 완충액 내에서 다양한 범위의 템플릿 농도에 걸쳐 멀티플렉스 PCR을 수행할 수 있습니다.
높은 특이도와 억제제 내성으로 인해, Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 formalin fixed paraffin-embedded (FFPE) 블록과 같이 고품질이 아닌 샘플 DNA 템플릿에서도 효율적인 증폭을 가능하게 합니다.
그림 15. FFPE-extracted DNA로부터 증폭 Platinum SuperFi II DNA 중합효소는Invitrogen RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE를 사용하여 추출한 10 ng의 마우스 DNA로부터 최대 0.4 kb까지 타겟을 성공적으로 증폭합니다. 분자량 마커는 TrackIt 100 bp DNA Ladder입니다.
반응 완충액이 제공되는 Platinum SuperFi II DNA 중합효소는 isostabilizing 구성요소를 사용하여 특별히 제조됩니다. 이 특별한 완충액 조성은 몇가지 장점을 제공합니다: 프라이머를 위한 Tm 계산 불필요, GC-rich 타겟의 더 강력한 증폭, 긴 염기서열의 더 효율적인 증폭, 고처리량 PCR을 위한 범용 PCR 프로토콜 가용성(표 1).
표 1. Platinum SuperFi II와 Platinum SuperFi DNA 중합효소 비교.
Platinum SuperFi II DNA 중합효소 | Platinum SuperFi DNA 중합효소 | |
---|---|---|
Fidelity (vs. Taq) | >300x | >300x |
Hot-start 변형 | 예 | 예 |
Tm 계산기 필요 | 아니오 (프라이머는 60°C에서 anneal) | 예 |
범용 PCR 프로토콜 | 예 | 아니오 |
GC-rich 증폭 | 예 (GC enhancer 필요 없음) | 예 (GC enhancer 권장) |
Long-range 증폭 | 최대 20 kb (향상된 성능) | 최대 20 kb |
벤치탑 안정성 | 최대 24 hr | 최대 24 hr |
억제제 내성 | 높음 | 높음 |
앰플리콘 3′ 말단 | 평활(Blunt) | 평활(Blunt) |
Certified low level of residual DNA (per 50 μL rxn) | ≤1 copy of bacterial DNA ≤0.3 copy of human DNA | ≤1 copy of bacterial DNA ≤0.2 copy of human DNA |
PCR 교육
PCR의 역사, 설정 시 고려사항, DNA 중합효소 선택의 중요성, 자주 사용되는 방법 및 애플리케이션, 문제해결 등에 대한 정보를 제공합니다.
PCR 및 cDNA 합성 지원 센터
end-point PCR 및 cDNA 애플리케이션에 대한 팁, 문제 해결 도움 및 리소스를 확인해 보십시오.
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PCR 효소 및 마스터 믹스와 관련된 추가 질문은 기술 애플리케이션 담당 과학자에게 이메일이나 전화로 문의하십시오.
달리 명시하지 않은 경우 모든 상표는 Thermo Fisher Scientific과 그 자회사의 재산입니다. Q5는 New England BioLabs Inc.의 상표입니다. PrimeSTAR는 Takara-Clontech Laboratories, Inc.의 상표입니다. Merck는 Merck KGaA의 상표입니다. KAPA HiFi HotStart는 Roche Inc.의 상표입니다. HotStar는 Qiagen GmbH의 상표입니다. Roche Expand는 Roche Molecular Systems Inc.의 상표입니다. PfuUltra는 Agilent, Inc.의 상표입니다.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.