One-Step RT-PCR System

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System에 사용되는 혁신적인 기술로 각 Primer의 Tm 최적화가 필요하지 않습니다. 60°C의 universal annealing temperature는 대부분의 primer에 적합하므로 최적화 단계를 최소화하고 시간을 절약하며 반응 설정 시 오류를 방지할 수 있습니다.(그림 1).

Figure 1. One-step RT-PCR cycling under two annealing conditions. Nine targets were amplified from 10 ng Universal Human Reference RNA (UHRR); the first batch was amplified using a universal annealing temperature of 60°C (left), and the second batch was amplified using annealing temperatures calculated with the Tm calculator for Platinum SuperFi DNA Polymerase (right). The molecular weight marker is Thermo Scientific GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use.

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System은 저농도의 target을 검출할 수 있는 매우 민감도가 높으며(그림 2), RNA 투입량이 제한적이어도 One-Step RT-PCR System이 가능합니다.

Figure 2. Target detection from low amounts of input RNA. Amplification of 0.43 kb fragment from serial dilution from 1 μg to 0.01 pg of UHRR with SuperScript IV UniPrime One-step RT-PCR System. The molecular weight marker is Thermo Scientific GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use.

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System은 RNA 정제에 사용되는 생물학적 시료 또는 시약이 함유하는 중합 화합물과 같은 일반 RT 및 PCR inhibitor의 영향을 견뎌낼 수 있습니다. 이와 같은 탁월한 견고성에 힘입어 RNA 시료의 순도에 크게 의존하지 않고도 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 그 외 one-step RT-PCR kits는 inhibitor의 영향을 받았습니다(그림 3).

Figure 3. Resistance to inhibitors. Detection of a 1 kb RNA target from 100 ng UHRR using the SuperScript IV One-step RT-PCR System or other one-step RT-PCR kits in reaction mixtures containing: (1) no inhibitor, (2) xylan (2.5 μg/μL), (3) humic acid (15 ng/μL), (4) SDS (0.013%), (5) Trozol (1.2%), or (6) LiCl (2.5 μg/μL).

혁신적인 two-phase hot-start activation mechanism을 포함하는 SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System은 room temperature 반응 설정이 가능하며 한편으로는 preassembled reactions의 안정성을 장시간 유지할 수 있습니다. Room temperature에서 장기간 보관한 후에도 매우 효율적이고 특이적인 증폭을 관찰할 수 있습니다.

• 최대 3 kb의 표적인 경우, Room temperature에서 24시간 동안 반응을 방치한 후에도 증폭을 성공적으로 관찰하였습니다(그림 4A).
• 표적의 길이가 더 긴 경우에는 reaction을 최대 4시간까지 유지할 수 있습니다(그림 4B).

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System에 처리 능력이 뛰어난 효소를 조합하면 광범위한 표적 길이를 증폭할 수 있습니다(그림 5). Full length의 cDNA는 10분 내로 합성이 가능하며, PCR step에서는 30초/kb의 extension time만 있으면 되므로 one-step RT-PCR kits 중에서도 가장 짧은 프로토콜에 해당합니다.

Figure 5. Versatility across a broad range of target lengths. Detection of RNA fragments ranging from 0.2 to 9.4 kb with the SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System and other one-step RT-PCR kits.

특이도, 처리량, universal annealing 등의 탁월한 기능을 갖춘 SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System은 높은 수준의 최적화가 없이도 multiplex가 가능합니다(그림 6).

Visual tracking이 가능한 시약이 포함된 제품의 경우, SuperScript IV RT Mix 는 red tracking dye를 포함하고 있으며 UniPrime RT-PCR Master mix는 blue tracking dye를 포함합니다. 반응 설정 중에 양쪽 용액이 혼합되면 최종 반응 혼합물은 보라색이 되므로, 반응 설정을 시각적으로 추적하여 피펫팅 오류를 방지할 수 있습니다(그림 7).

네, 가능합니다. SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System은 universal 60°C annealing temperature와 Tm 계산기로 산출한 annealing temperature 양쪽 모두에서 사용할 수 있습니다.

긴 fragment의 one-step RT-PCR 에서는 우수실험실관리기준을 준수하시는 것이 바람직합니다. 고품질의 템플릿(순도가 높고 신선하며 손상되지 않은)과 새 primer 솔루션을 사용해 주세요. 고려해야 할 최적화 단계는 프로토콜의 권장 사항에 따라 extension time과 템플릿 양을 늘리는 것을 포함합니다. 당사의 reverse transcription 교육 resource를를 확인하여 RT-PCR 반응 최적화 및 설정에 대해 자세히 알아보세요.

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR system은 일반적인 one-step RT-PCR products보다 높은 온도에서 cDNA 합성이 가능합니다. GC가 풍부하거나 구조적으로 복잡한 RNA 템플릿의 경우 cDNA 합성 배양 온도를 최대 55 ~ 65°C까지 높이는 것이 좋습니다.

SuperScript IV One-Step RT-PCR System 및 SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System에 사용되는 two-phase hot-start mechanism은 One-Step RT-PCR workflow에서 RT 및 PCR enzyme을 순차적으로 활성화시키기 위한 것입니다. 주변 온도에서 SuperScript IV RT는 열에 민감한 RT-blocker를 사용하여 비활성 상태를 유지합니다. 약 45°C의 first hot-start activation 단계에서 RT-blocker가 해제되고 첫째 가닥(first-strand) cDNA의 합성을 시작합니다. 두 번째 활성화 단계에서는 반응을 98°C로 가열하여 DNA 중합효소를 활성화하며, 동시에 SuperScript IV RT를 비활성화합니다. 해당 메커니즘은 RT 및 PCR 효소의 활성을 분리하여 최고 수준의 RT-PCR 특이도와 수율을 보장합니다.

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System은 blunt-end cloning vectors로 직접 클로닝할 수 있는 blunt-end PCR 산물을 생성합니다. 3′ dA- overhangs이 PCR 이후에 추가될 경우 TA 클로닝도 가능합니다. 클로닝 응용 분야에서의 각종 PCR 효소 사용에 대한 자세한 내용은 PCR 교육 자료를 참조하세요.

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System의 컬러 형식이 포함하는 적색/청색 추적 염료는 E-Gel agarose gels의 전기영동에 지장을 주지 않습니다. E-Gel 프리캐스트 아가로스 겔을 사용한 분리를 최적화하려면 특정 E-gel에 대한 권장 사항을 준수하여 시료를 2 ~ 30배 희석하는 것이 좋습니다.

SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System은 modified Invitrogen Platinum SuperFi II DNA polymerase가 포함된 2X UniPrime RT-PCR master mix를 포함하고 있어 높은 특이도와 높은 수율을 보장하며 염기서열 정확도가 필요한 응용 분야에 특히 이상적입니다. 일반적인 proofreading enzyme과 달리 해당 polymerase는 dUTP와 호환됩니다.

네, 가능합니다. SuperScript IV UniPrime One-Step RT-PCR System으로 room temperature에서 반응을 설정할 수 있습니다. 또한 혁신적인 two-phase hot start mechanism을 채택하고 있으므로 preassembled reaction은 최대 3 kb가 target인 경우 최대 24시간, >3 kb 표적인 경우 최대 4시간 동안 room temperature에서 안정성을 유지합니다.