웨스턴 블로팅 트랜스퍼 방법

단백질 트랜스퍼는 웨스턴 블로팅 분석에서 중요한 단계입니다. 이 단계에는 전기영동을 통해 젤에서 분리된 단백질을 고체 지지 매트릭스로 트랜스퍼하는 과정이 포함되어 있습니다. 단백질을 고체 지지 매트릭스에 고정하면 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 특정 단백질을 쉽게 검출할 수 있습니다. 일반적인 고체 매트릭스는 니트로셀룰로오스, PVDF 또는 나일론 재질의 멤브레인 시트입니다. 이 문서에서는 트랜스퍼 방법을 검토 및 비교하고, 멤브레인의 특성 및 특정 제품을 선택해야 하는 이유를 설명하며, 웨스턴 블랏 트랜스퍼에 사용되는 다양한 트랜스퍼 버퍼 레시피를 제공합니다.

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페이지 내용

• 트랜스퍼 방법
• 트랜스퍼 조건
• 블로팅 멤브레인
• 트랜스퍼 버퍼

단백질 웨스턴 블로팅은 1979년에 Towbin 등에 의해 도입되었으며 지금은 단백질 분석을 위한 일상적이고 기본적인 기술입니다. 단백질 블로팅 또는 이뮤노블로팅이라고도 하는 웨스턴 블로팅은 항체를 사용하여 멤브레인에 결합된 특정 단백질 표적을 식별합니다. 항체-항원 상호작용의 특이성을 통해 세포 또는 조직 용해물과 같은 복합 단백질 혼합물 중에서 표적 단백질을 식별할 수 있습니다. 웨스턴 블로팅은 관심 단백질에 관한 정성적 및 세미-정량적 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

웨스턴 블로팅 절차의 첫 번째 단계는 변성 젤 전기영동(즉, 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 또는 SDS-PAGE) 또는 기본 PAGE를 사용하여 시료에서 단백질을 크기별로 분리하는 것입니다. 전기영동 후 분리된 단백질은 일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인과 같은 고체 지지 매트릭스로 트랜스퍼되거나 "블로팅"됩니다. 단백질 분리가 필요하지 않은 절차에서는 도트(dot) 블로팅이라는 접근 방식을 사용하여 스포팅을 통해 시료를 멤브레인에 직접 적용할 수 있습니다.

젤에서 멤브레인으로의 단백질 트랜스퍼는 다음 두 가지 이유로 필요합니다.

1. 깨지기 쉬운 젤에 비해 멤브레인은 우수한 핸들링 능력을 제공함
2. 멤브레인에서 항체와 같은 거대분자의 표적 단백질 접근성이 더욱 향상됨

트랜스퍼 후 멤브레인 표면에 항체가 비특이적 결합으로 결합되지 않도록 멤브레인을 블로킹해야 합니다. 그런 다음 트랜스퍼된 단백질을 항체 및 검출 프로브(예: 효소, 형광단, 동위원소)를 사용하여 순차적으로 프로빙합니다. 그런 다음 적절한 방법으로 국소화된 프로브를 감지하여 표적 단백질의 위치와 상대적 존재비를 문서화합니다.

단백질 블로팅 워크플로우에서의 면역검출 문제 외에 젤 매트릭스에서 멤브레인으로 단백질을 트랜스퍼하는 과정도 잠재적인 장애물 중 하나입니다. 단백질 트랜스퍼 효율은 화학적 성질, 젤의 두께, 트랜스퍼되는 단백질의 분자량, 사용되는 멤브레인의 유형 및 트랜스퍼 버퍼, 트랜스퍼 방법 등에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

확산 트랜스퍼, 모세관 트랜스퍼, 열 가속 대류 트랜스퍼, 진공 블로팅, 일렉트로블로팅(일렉트로트랜스퍼) 등 다양한 트랜스퍼 방법이 있습니다. 이러한 방법 중 일렉트로블로팅은 다른 방법보다 빠르고 효율적이기 때문에 웨스턴 블로팅에 가장 널리 사용되는 방법으로 부상했습니다. SDS-PAGE 또는 기본 젤에서 멤브레인으로 단백질을 일렉트로트랜스퍼하는 방법에는 세 가지가 있습니다.

• 습식 일렉트로블로팅 (기존의 습식 또는 탱크 트랜스퍼)
• 세미-드라이 일렉트로블로팅(세미-드라이 트랜스퍼)
• 드라이 일렉트로블로팅(드라이 트랜스퍼)

일렉트로블로팅

일렉트로블로팅 또는 일렉트로트랜스퍼 방법은 단백질을 젤에서 빠져나오게 하여 이동시키기 위해 단백질의 전기영동 이동성에 의존합니다. 이 기술은 단백질을 함유한 폴리아크릴아미드 젤을 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF 멤브레인 또는 기타 적절한 단백질 결합 지지체 부분과 직접 접촉시키는 것을 포함합니다. 다음으로 젤-멤브레인 쌍은 일반적으로 전도 용액(트랜스퍼 버퍼)에 잠긴 두 전극 사이에서 "샌드위치"형태로 압착됩니다. 전기장이 가해지면 단백질이 젤에서 빠져나와 멤브레인 표면으로 이동하고 여기에서 단백질이 단단히 부착됩니다. 이 과정을 거친 멤브레인은 폴리아크릴아미드 젤에 있던 단백질 패턴의 사본이 됩니다.

습식 또는 탱크 트랜스퍼

습식 트랜스퍼를 수행할 때 트랜스퍼 버퍼에서 젤을 먼저 평형화시킵니다. 그런 다음 젤을 "트랜스퍼 샌드위치"(필터 페이퍼-젤-멤브레인-필터 페이퍼)에 넣고 패드로 완충시킨 다음 지지 그리드로 함께 압착합니다. 지지된 젤 샌드위치는 스테인리스 스틸/백금 와이어 전극 사이의 탱크에 수직으로 배치하고 탱크를 트랜스퍼 버퍼로 채웁니다.

일정한 전류(0.1 ~ 1 A) 또는 전압(5 ~ 30 V)에서 최소 1시간 ~ 밤새 수행되는 표준 전기장 옵션을 통해 여러 젤을 일렉트로트랜스퍼할 수 있습니다. 단일 젤을 트랜스퍼하기 위해 높은 전기장 옵션을 사용하면 트랜스퍼 시간을 30분 정도로 줄일 수 있지만, 고전압(최대 200 V) 또는 고전류(최대 1.6 A)를 사용해야 하며 이로 인해 생성되는 상당한 양의 열을 분산시키기 위한 냉각 시스템이 필요합니다.

14–116 kDa의 단백질에 대해 80–100%의 트랜스퍼 효율을 달성할 수 있습니다. 트랜스퍼 효율은 트랜스퍼 시간이 증가함에 따라 향상되며 일반적으로 고분자량 단백질보다 저분자량 단백질의 경우 더 우수합니다. 그러나 시간이 증가함에 따라, 특히 공극 크기가 더 큰(0.45 μm) 멤브레인을 사용할 때 저분자량(<30 kDa) 단백질의 경우 멤브레인을 통해 단백질이 과도하게 트랜스퍼(스트리핑, 블로우 스루)될 위험이 있습니다.

동영상 보기:Invitrogen 미니 블랏 모듈을 사용하여 웨스턴 습식 트랜스퍼를 수행하는 방법
더 알아보기:습식 탱크 트랜스퍼 시스템

세미-드라이 일렉트로블로팅(세미-드라이 트랜스퍼)

세미-드라이 단백질 트랜스퍼에서 트랜스퍼 샌드위치는 두 개의 플레이트 전극 사이에서 수평으로 놓입니다. 젤 주위가 아닌 젤을 통과하는 전류를 최대화하여 습식 탱크보다 트랜스퍼 속도가 향상됩니다. 이를 위해 트랜스퍼에 사용되는 버퍼의 양은 트랜스퍼 샌드위치에 포함된 양으로 제한됩니다. 이 기술에서는 돌출부가 없도록 멤브레인과 필터 페이퍼 시트를 젤 크기로 자르고 젤과 필터 페이퍼가 트랜스퍼 버퍼에서 완전히 평형화되도록 하는 것이 중요합니다. 트랜스퍼 시에 더 많은 트랜스퍼 버퍼를 보유할 수 있도록 매우 두꺼운 필터 페이퍼(약 3 mm 두께)를 사용하는 것이 일반적입니다.

메탄올은 트랜스퍼 버퍼에 포함될 수 있지만 일반적으로 생략됩니다. 일렉트로트랜스퍼는 10 ~ 60분 동안 일정한 전류(0.1 ~ 최대 0.4 A) 또는 전압(10 ~ 25 V)에서 수행됩니다. 고속 블로팅 기술은 메탄올 없이 더 높은 이온 강도 트랜스퍼 버퍼와 고전류 전원 공급 장치를 사용하여 트랜스퍼 시간을 10분 미만으로 줄입니다. 고속 방법에서 전류는 일정하게 유지되며 전압은 최대 25 V로 제한됩니다.

동영상 보기:Invitrogen Power Blotter를 사용하여 웨스턴 블로팅 세미-드라이 트랜스퍼를 수행하는 방법
더 알아보기:세미-드라이 트랜스퍼 시스템

드라이 일렉트로블로팅(드라이 트랜스퍼)

드라이 일렉트로블로팅 방법은 기존의 트랜스퍼 버퍼를 사용하지 않는 혁신적인 구성 요소가 포함된 특수 트랜스퍼 샌드위치를 사용합니다. 버퍼 탱크나 적신 필터 페이퍼 대신 버퍼가 포함된 고유한 젤 매트릭스(트랜스퍼 스택)가 사용됩니다. 젤 매트릭스의 이온 밀도가 높아 신속한 단백질 트랜스퍼가 가능합니다. 블로팅 중 구리 애노드는 물 전기분해로 인한 산소 가스를 생성하지 않으므로 블랏의 왜곡이 줄어듭니다. 습식 및 세미-드라이를 포함한 기존의 단백질 트랜스퍼 기술은 산소를 생성하는 불활성 전극을 사용합니다. 일반적으로 트랜스퍼 시간은 전극 간 짧은 거리, 높은 전기장 강도 및 높은 전류로 인해 단축됩니다. 버퍼를 준비할 필요가 없으므로 다른 트랜스퍼 방법에 비해 설정 및 세척 시간이 크게 단축됩니다.

동영상 보기:Invitrogen iBlot 3 드라이 블로팅 시스템을 사용하여 웨스턴 블랏 드라이 트랜스퍼를 수행하는 방법
더 알아보기:드라이 트랜스퍼 시스템

웨스턴 블랏 트랜스퍼 방법 비교: 습식, 세미-드라이 및 드라이 트랜스퍼 방법

젤에서 블로팅 멤브레인으로의 효율적이고 안정적인 단백질 트랜스퍼는 성공적인 웨스턴 검출 실험의 초석입니다. 결과의 정확성은 웨스턴 블로팅 방법의 트랜스퍼 효율성에 따라 달라집니다. 기존의 습식 트랜스퍼는 효율성이 높지만 시간과 노력이 많이 소요됩니다. 세미-드라이 블로팅은 기존 습식 트랜스퍼에 비해 편리하고 시간이 절약되며, 다양한 유형의 버퍼 시스템이나 사전 조립 또는 자체 제작 트랜스퍼 스택을 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다. 그러나 세미-드라이 트랜스퍼는 분자량이 큰 단백질(>300 kDa)의 트랜스퍼 효율이 낮을 수 있습니다. 드라이 일렉트로블로팅은 추가 버퍼가 필요하지 않기 때문에 속도와 편리성을 모두 갖춘 고품질 트랜스퍼 성능을 제공합니다.

기타 트랜스퍼 방법

확산 블로팅

확산 블로팅은 분자가 고농도 영역에서 저농도 영역으로 이동하는 분자의 열 운동에 의존합니다. 블로팅 방법에서 분자의 트랜스퍼는 젤 매트릭스에서 빠져나오는 단백질의 확산 및 트랜스퍼 멤브레인으로의 흡수에 따라 달라집니다. 흡수된 단백질이 용액에서 "제거됨"에 따라 단백질을 멤브레인으로 유도하는 농도 구배를 유지하는 데 도움이 됩니다. 원래 (등전점 포커싱) IEF 젤에서 단백질을 트랜스퍼하기 위해 개발된 확산 블로팅은 다른 거대분자, 특히 핵산에도 유용합니다. 확산 블로팅은 하나의 젤에서 여러 이뮤노블랏을 준비할 때 가장 유용합니다. 이 방법으로 얻은 블랏은 질량분석법으로 단백질을 식별하고 지모그래피(zymography)로 단백질을 분석하는 데에도 사용할 수 있습니다. 단백질 회수율은 일반적으로 트랜스퍼 가능한 총 단백질의 25~50%로 다른 트랜스퍼 방법보다 낮습니다. 또한 단백질 트랜스퍼는 정량적이지 않습니다. SDS-PAGE 젤에서 분자량이 매우 큰 단백질의 경우 확산 블로팅이 어려울 수 있지만 분자량이 작은 단백질은 대개 쉽게 트랜스퍼됩니다.

진공 블로팅(진공 모세관 블로팅)

진공 블로팅은 모세관 블로팅의 변형으로, 저장소의 버퍼가 젤과 블로팅 멤브레인을 통해 드라이 티슈 페이퍼 또는 기타 흡수성 물질로 유입됩니다. 진공 블로팅은 슬래브 젤 드라이어 시스템 또는 기타 적합한 젤 건조 장비를 사용하여 젤에서 니트로셀룰로오스와 같은 멤브레인으로 폴리펩타이드를 끌어당깁니다. 강한 진공은 젤이나 트랜스퍼 멤브레인을 파손시킬 수 있어 강한 펌프를 사용할 수 없습니다. 젤은 진공 상태에서 45분이 지나면 건조해질 수 있으므로 충분한 예비 버퍼가 필요합니다. 젤은 트랜스퍼 후 멤브레인에 달라붙는 경향이 있지만 젤의 재수화는 분리를 촉진하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다.

진공 블로팅의 트랜스퍼 효율은 30 ~ 65% 범위 내에서 변하며, 저분자량 단백질(14.3 kDa)은 이 효율 범위의 상한에 있고 고분자량 단백질(200 kDa)은 하한에 있습니다. 확산 블로팅과 마찬가지로 진공 블로팅도 정성적 트랜스퍼만 가능합니다.

사용되는 트랜스퍼 방법에 따라 트랜스퍼에 사용되는 전압 및 시간이 달라집니다. 다음은 서로 다른 트랜스퍼 방법에 사용되는 조건의 예입니다. 표적 단백질의 분자량에 따라 보다 효율적인 트랜스퍼를 위해 트랜스퍼 시간을 줄이거나(저분자량 단백질) 늘릴 수 있습니다(고분자량 단백질).

웨스턴 블로팅을 위한 가장 일반적인 고정화 멤브레인은 니트로셀룰로오스, PVDF 및 나일론입니다. 이러한 멤브레인은 다음과 같은 이점이 있어 주로 사용됩니다.

• 큰 표면적 대 부피 비율
• 높은 결합 능력
• 고정화된 거대분자의 장기간 보관
• 간편한 사용
• 낮은 백그라운드 신호 및 재현성을 위한 최적화 가능성

웨스턴 블랏 멤브레인은 대개 시트 또는 롤 형태로 제공되며 일반적으로 두께가 100 μm이고 일반적인 공극 크기는 0.1, 0.2 또는 0.45 μm입니다. 대부분의 단백질은 0.45 µm 공극 크기 멤브레인을 사용하여 성공적으로 블로팅할 수 있으며 저분자량 단백질 또는 펩타이드(<20 kDa)에는 0.1 또는 0.2 µm 공극 크기의 멤브레인이 권장됩니다.

니트로셀룰로오스 멤브레인

니트로셀룰로오스 멤브레인은 높은 단백질 결합 친화성, 다양한 검출 방법과의 호환성, 단백질 및 당단백질을 고정하는 능력 때문에 단백질 블로팅에 널리 사용되는 매트릭스입니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인은 서던 및 노던 블랏, 아미노산 분석 및 도트/슬롯 블랏 애플리케이션에도 사용할 수 있습니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인의 단백질 결합 용량은 80–100 µg/cm²입니다. 단백질 고정화는 소수성 상호작용에 의해 발생하는 것으로 여겨지며 높은 염 농도와 낮은 메탄올 농도는 특히 분자량이 더 큰 단백질의 경우 전기영동 트랜스퍼 중에 멤브레인에 대한 단백질 고정화를 향상시킵니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인은 비가역적 단백질 결합 효율이 높아 여전히 인기 있는 옵션입니다.

PVDF 멤브레인

PVDF 멤브레인은 단백질 및 핵산에 대해 높은 결합 친화력을 가지며 웨스턴, 서던, 노던 및 도트 블랏과 같은 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. PVDF 멤브레인은 소수성이 매우 강하며 트랜스퍼 버퍼에 담그기 전에 메탄올 또는 에탄올에 미리 적셔야 합니다. 이러한 애플리케이션에서는 쌍극자 및 소수성 상호작용을 통해 결합이 발생할 가능성이 높습니다. PVDF 멤브레인의 단백질 결합 용량은 170–200 µg/cm²이며 더 큰 소수성으로 인해 다른 지지체보다 흡착된 단백질의 머무름 성능이 더 우수합니다. PVDF 멤브레인의 소수성으로 인해 소수성 단백질(예: 멤브레인 단백질)용으로 선호되는 제품입니다. PVDF는 니트로셀룰로오스보다 부서지거나 깨질 가능성이 적으며 새로운 항체 조합을 사용하여 다양한 표적에 대해 여러 차례의 재처리(스트리핑 및 재프로빙 절차)가 필요한 웨스턴 블로팅 실험에 유용할 수 있습니다.

나일론 멤브레인

하전된 나일론(폴리아미드) 멤브레인은 이온, 정전기 및 소수성 상호작용을 통해 단백질과 핵산을 결합합니다. 나일론 멤브레인은 매우 민감하고 일관된 트랜스퍼 결과를 제공하며 단백질 결합 용량은 480 µg/cm²입니다. 나일론 멤브레인은 내구성이 높아 스트리핑 및 재프로빙 절차가 필요한 웨스턴 블로팅 실험에서 이점을 제공합니다. 블로팅 애플리케이션에서 나일론 멤브레인을 사용하는 데 있어 큰 단점은 비특이적 결합과 SDS와 같은 음이온에 대한 강한 결합 가능성입니다.

블로팅 멤브레인 비교

멤브레인을 선택할 때 단백질의 특성(예: 전하, 소수성) 및 다운스트림 애플리케이션에 따라 사용할 멤브레인이 결정됩니다. 최적의 멤브레인을 찾기 위해서는 서로 다른 멤브레인에서 원하는 특정 단백질을 사용한 실험이 필요할 수 있습니다. 각 멤브레인의 특성과 장단점을 알면 애플리케이션에 가장 적합한 형식을 결정하는 데 도움이 됩니다.

더 알아보기:트랜스퍼 멤브레인

습식 트랜스퍼 방법에는 몇 가지 서로 다른 트랜스퍼 버퍼가 사용됩니다. 사용되는 버퍼 유형은 관심 단백질, 젤 버퍼링 시스템 및 트랜스퍼 방법에 따라 달라집니다.

대부분의 실험에서 음전하를 띤 단백질은 멤브레인을 통과할 수 있기 때문에 SDS는 웨스턴 트랜스퍼 버퍼에서 제외됩니다. 일반적으로 SDS-PAGE 분리에서 단백질과 결합된 SDS가 충분하여 젤에서 빠져나온 단백질을 지지 멤브레인으로 효과적으로 옮길 수 있습니다. 침전되는 경향이 있는 단백질의 경우 낮은 농도의 SDS(<0.01%)를 추가해야 할 수 있습니다. 트랜스퍼 버퍼에 SDS를 추가하려면 멤브레인을 통한 단백질 과다 트랜스퍼("블로우 스루(blow through)"라고도 함)을 방지하기 위해 다른 트랜스퍼 파라미터(예: 시간, 전류)를 최적화해야 할 수 있습니다.

메탄올은 SDS-PAGE에 의한 분리에서 단백질로부터 SDS를 제거하는 데 도움을 주어 지지 멤브레인에 결합하는 능력을 높이기 때문에 대부분의 트랜스퍼 버퍼 제형에 포함됩니다. 그러나 메탄올은 다운스트림 분석에 필요한 효소를 불활성화시킬 수 있으며 젤과 멤브레인을 수축시켜 메탄올에서 용해도가 낮은 고분자량 단백질(150 kDa)의 트랜스퍼 시간을 증가시킬 수 있습니다. 그러나 메탄올이 없는 경우 단백질 젤이 이온 강도가 낮은 버퍼에서 팽창할 수 있으므로 밴드 왜곡을 방지하기 위해 젤을 30분에서 1시간 동안 미리 팽창시키는 것이 좋습니다.

습식 트랜스퍼를 위한 일반적인 트랜스퍼 버퍼

더 알아보기:트랜스퍼 버퍼

1. Towbin, et al. (1979) Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications.PNAS 76:4350–4354.
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• 핸드북: 단백질 젤 전기영동 기술 핸드북
• 핸드북: 웨스턴 블로팅 기술 핸드북
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• 애플리케이션 노트: iBlot 2 젤 트랜스퍼 장치를 사용한 고분자량 단백질의 트랜스퍼