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Productos y soluciones para inmunoprecipitación (IP)
Las tendencias en publicacionesmuestran que el método de más rápido crecimiento para inmunoprecipitación incorpora el uso de gránulos magnéticos y que los productos Invitrogen Dynabeads son los más utilizados y referenciados en esta tendencia. ¿Por qué? Porque los gránulos magnéticos Dynabeads ofrecen el mejor equilibrio entre capacidad y rendimiento, reproducibilidad, pureza y coste para el aislamiento a menor escala de proteínas específicas (por ejemplo, inmunoprecipitación, IP) y complejos de proteínas (coinmunoprecipitación, coIP).
Las necesidades de investigación y purificación de proteínas han cambiado considerablemente desde la introducción de la «pulpa de Sepharose» basada en agarosa en la década de 1970, cuando el objetivo era purificar grandes cantidades de proteína o anticuerpos. Si se trata de su aplicación principal, las columnas basadas en agarosa/resina siguen siendo uno de los mejores métodos.
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Contenido de la página
- Ventajas de los gránulos magnéticos para IP
- Cómo funciona (IP con gránulos magnéticos)
- Encuentre el producto de inmunoprecipitación adecuado
- Productos de IP de unión de anticuerpos
- Productos de IP de unión de biotina
- Productos de IP de proteínas de fusión
- Datos de rendimiento: Dynabeads frente a las alternativas
- Tendencias en publicaciones sobre IP
- Vídeos
- Packs de inicio de IP: ahorre entre un 21 y un 24 %
Recursos populares
- IP con agarosa y otras resinas
- Productos para la técnica de precipitación «pulldown» de proteína NA, RIP y ChIP
- Coinmunoprecipitación
- Automatización de IP en la plataforma KingFisher
- Dynabeads activados por superficie
- Protocolo de IP con entrecruzamiento mediante Dynabeads
- Preguntas frecuentes sobre IP con Dynabeads
- Mitos de la IP (incluye vídeos)
- Citas para IP con Dynabeads
- Imanes para IP
Ventajas de los gránulos magnéticos para IP
Los gránulos magnéticos se han convertido en el criterio de referencia para los ensayos de inmunoprecipitación y la técnica de precipitación «pulldown» porque ofrecen una manera más rápida, fácil y eficiente de precipitar las proteínas de interés que la agarosa de Sepharose tradicional u otras resinas basadas en agarosa. Los gránulos magnéticos Dynabeads ayudan a lograr el mejor equilibrio entre alto rendimiento y reproducibilidad con una baja adherencia inespecífica y un bajo coste. Consulte estos vídeos sobre mitos de la IP que son una excelente forma de entender visualmente las ventajas de los gránulos magnéticos Dynabeads.
Resumen de las ventajas de la tecnología Dynabeads:
- Bajo fondo: unión inespecífica mínima o inexistente, sin necesidad de preinspección para una producción de proteínas de alta pureza.
- Altamente reproducible: los gránulos uniformes garantizan los resultados más coherentes.
- Muy sensible: el método más citado para aplicaciones sensibles, como ChIP e IP de proteínas de baja abundancia.
- Rapidez y sencillez: protocolo de < 40 min sin pasos de centrifugación ni preinspección.
- Ahorro de anticuerpos: la unión se produce en la suave superficie exterior de los gránulos, que conserva los valiosos anticuerpos y es compatible con una solución rentable por muestra.
- Flexible: productos para inmunoprecipitación (IP), coinmunoprecipitación (co-IP), técnica de precipitación «pulldown» y ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para protocolos manuales y automáticos.
- Automatización del protocolo de IP: descubra cómo la plataforma Thermo Scientific KingFisher ahora admite la automatización de la inmunoprecipitación.
Cómo funciona (IP con gránulos magnéticos)
La inmunoprecipitación es fácil y rápida cuando se utilizan gránulos magnéticos Dynabeads como soporte sólido para el aislamiento de proteínas. Se puede realizar en cuatro sencillos pasos:
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This procedure is simple, fast, requires no preclearing step, and results in high-target protein purity, yield, and consistent results.
This procedure is simple, fast, requires no preclearing step, and results in high-target protein purity, yield, and consistent results.
- Unión del anticuerpo a los gránulos. Los gránulos magnéticos Dynabeads cuentan con un revestimiento previo de proteína A, proteína G, anticuerpo IgG antirratón o anticuerpo IgG anticonejo, y debido a una rápida cinética se unen al anticuerpo añadido en solo 10 minutos. Los anticuerpos biotinilados también se pueden utilizar en combinación con Dynabeads acoplados con estreptavidina. Lave los gránulos una vez se encuentren en el imán para eliminar los anticuerpos que no estén unidos.
- Adición de la muestra a los gránulos. Añada la muestra con proteínas a los gránulos lavados con anticuerpos unidos e incube durante otros 10 minutos para unir la proteína objetivo de su interés. Si la proteína es de baja abundancia o baja afinidad, la incubación puede aumentar hasta 1 hora o durar toda la noche; pero en general, es suficiente con una incubación de 10 minutos.
- Lavado de los gránulos unidos a proteínas. Para garantizar una alta pureza de la proteína objetivo unida, los gránulos se deben lavar de 2 a 4 veces con un tampón de lavado en el imán para eliminar todas las proteínas no unidas. El eficiente proceso de aislamiento garantiza una alta relación señal-ruido.
- Elución de la proteína. Si es necesario, la proteína se puede eluir de los gránulos mediante un procedimiento de elución moderado o un procedimiento de desnaturalización (para obtener más información, consulte la descripción de elución más adelante).
Las proteínas A o G recombinantes presentes en los gránulos no contienen puntos de unión de albúmina, lo que evita la purificación conjunta de proteínas contaminantes. La unión de anticuerpos a los gránulos en la solución es una reacción de equilibrio. Para capturar el máximo número de anticuerpos, el volumen de reacción debe mantenerse bajo con el fin de mantener altas concentraciones de gránulos y anticuerpos. No es necesario tratar la muestra previamente (ni siquiera las muestras viscosas), por lo que no se debe realizar ninguna dilución de la muestra ni de los gránulos. Si se sospecha que la concentración de anticuerpos en la muestra es muy baja, se puede aumentar la cantidad de gránulos.
Como alternativa a la elución de anticuerpos de los gránulos, los Dynabeads se pueden volver a suspender en un tampón de fosfato sódico. Para prevenir la coelución, es posible unir el anticuerpo a la proteína A/G en los gránulos antes de la inmunoprecipitación. Esto no es necesario para SDS-PAGE posterior seguido de autorradiografía o western blotting, y es opcional para la tinción con tinte Coomassie o plata.
Elija este producto si tiene un anticuerpo que reconoce su proteína
La elección de productos de unión de anticuerpos depende del ensayo posterior.
La unión de anticuerpos es el método más común y se utiliza cuando el anticuerpo objetivo se puede unir directamente a los gránulos o indirectamente a un ligando con revestimiento previo en los gránulos magnéticos.
Guía de selección de productos de unión de anticuerpos
| Proteína A, G, A/G | Anticuerpos secundarios (antirratón, anticonejo) | Gránulos activados por superficie (epoxi)* | |
|---|---|---|---|
| Propiedades de unión | Unión de anticuerpos no covalente | Unión de anticuerpos no covalente | Unión de anticuerpos covalente |
| Anticuerpo coeluido de los gránulos | Sí† | Sí† | No |
| Tipo de ligando | Los diferentes ligandos unen distintas especies y subclases de anticuerpos con diferente especificidad‡ | Antirratón une IgG1, IgG2a, IgG2b de ratón; anticonejo une todos los IgG de conejo | Todos los anticuerpos |
| Compatible con espectrometría de masas | Sí (proteína A/G); No validado (proteína A, G) | No | Sí |
| Unión inespecífica | Baja | Baja | Ultrabaja |
| Temperatura y tiempo de unión de anticuerpos (RT=temperatura ambiente) |
| > 30 min, 2-8 °C | 16-24 h, 37 °C |
| Productos | Solo gránulos:Kits: | Solo gránulos: | Kits: |
* Vea más opciones de Dynabeads activados por superficie para la unión y la captura de objetivos adicionales.
† El entrecruzamiento se puede realizar para evitar la coelución del anticuerpo, pero esto puede reducir la producción del antígeno objetivo.
‡ Obtenga más información sobre qué proteínas de unión de anticuerpos son las mejores para su anticuerpo de IP.
† El entrecruzamiento se puede realizar para evitar la coelución del anticuerpo, pero esto puede reducir la producción del antígeno objetivo.
‡ Obtenga más información sobre qué proteínas de unión de anticuerpos son las mejores para su anticuerpo de IP.
Elija este producto si tiene un anticuerpo biotinilado (o ligando) que reconoce su proteína
Entre las principales ventajas de utilizar un anticuerpo biotinilado con gránulos recubiertos de estreptavidina para IP se incluyen:
- Si tiene una muestra rica en IgG solubles
- Si tiene un anticuerpo recombinante que carece de regiones Fc
- Si ya tiene Dynabeads recubiertos de estreptavidina en el laboratorio
- Si necesita un gránulo compatible con espectrometría de masas (los Dynabeads con revestimiento secundario y revestimiento de epoxi también son compatibles con espectrometría de masas)
Para exista flexibilidad, hay disponibles cuatro tipos diferentes de Dynabeads acoplados con estreptavidina. Consulte la guía de selección de estreptavidina Dynabeads para ver las diferentes características.
En los últimos 25 años, se han utilizado ampliamente los Dynabeads acoplados con estreptavidina junto con un ligando biotinilado y se citan en miles de documentos para diversas aplicaciones manuales y automatizadas. La aplicación más utilizada para la estreptavidina Dynabeads es la purificación de ácidos nucleicos y los flujos de trabajo de secuenciación de última generación (NGS), pero también se utilizan para inmunoprecipitación (IP).
Elija este producto si tiene una proteína recombinante (con etiqueta de fusión)
Entre las etiquetas de fusión más populares para la expresión de proteínas recombinantes se incluyen:
- Etiqueta His: se compone de una cadena de entre seis y nueve residuos de histidina; se utiliza principalmente para la purificación mediante la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC).
- Etiqueta GST: se compone de glutatión S-transferasa (GST), una proteína completa de 211 aminoácidos (26 kDa); se usa principalmente para la purificación mediante resina de glutatión-agarosa.
- Etiqueta HA: se compone de un péptido (YPYDVPDYA) derivado de la proteína hemaglutinina (HA) de la gripe humana; los anticuerpos anti-HA inmovilizados se utilizan para inmunoprecipitar las proteínas recombinantes con etiqueta HA.
- Etiqueta c-Myc: se compone de un péptido (EQKLISEEEDL) derivado del oncogén c-myc humano (p62 c-myc); los anticuerpos anti-c-Myc inmovilizados se utilizan para inmunoprecipitar las proteínas recombinantes etiquetadas con c-Myc.
- Etiqueta FLAG: se compone de un péptido (DYKDDDDK) que es reconocido por un anticuerpo monoclonal de rata de alta afinidad inmovilizado (clon L5); se utiliza principalmente para el aislamiento de complejos de proteínas con varias subunidades, porque el proceso de purificación moderado tiende a no alterar estas interacciones.
His y GST no son verdaderas etiquetas de epítopo, porque normalmente no se purifican ni se detectan mediante anticuerpos específicos. Por el contrario, las etiquetas HA y c-Myc son verdaderas etiquetas de epítopo, porque sus únicos medios de purificación o detección es mediante anticuerpos específicos. Las etiquetas de epítopo rara vez se utilizan para la purificación a granel, pero se emplean con mayor frecuencia para la inmunoprecipitación o la coinmunoprecipitación (IP, co-IP). Sin embargo, los cuatro sistemas de etiquetas se pueden utilizar para aplicaciones de purificación o técnicas de precipitación «pulldown».
Si tiene un anticuerpo biotinilado que reconoce la proteína que desea capturar, puede crear su propio producto de afinidad con uno de estos productos.
Elija este producto si tiene un anticuerpo que reconoce su proteína
La elección de productos de unión de anticuerpos depende del ensayo posterior.
La unión de anticuerpos es el método más común y se utiliza cuando el anticuerpo objetivo se puede unir directamente a los gránulos o indirectamente a un ligando con revestimiento previo en los gránulos magnéticos.
Guía de selección de productos de unión de anticuerpos
| Proteína A, G, A/G | Anticuerpos secundarios (antirratón, anticonejo) | Gránulos activados por superficie (epoxi)* | |
|---|---|---|---|
| Propiedades de unión | Unión de anticuerpos no covalente | Unión de anticuerpos no covalente | Unión de anticuerpos covalente |
| Anticuerpo coeluido de los gránulos | Sí† | Sí† | No |
| Tipo de ligando | Los diferentes ligandos unen distintas especies y subclases de anticuerpos con diferente especificidad‡ | Antirratón une IgG1, IgG2a, IgG2b de ratón; anticonejo une todos los IgG de conejo | Todos los anticuerpos |
| Compatible con espectrometría de masas | Sí (proteína A/G); No validado (proteína A, G) | No | Sí |
| Unión inespecífica | Baja | Baja | Ultrabaja |
| Temperatura y tiempo de unión de anticuerpos (RT=temperatura ambiente) |
| > 30 min, 2-8 °C | 16-24 h, 37 °C |
| Productos | Solo gránulos:Kits: | Solo gránulos: | Kits: |
* Vea más opciones de Dynabeads activados por superficie para la unión y la captura de objetivos adicionales.
† El entrecruzamiento se puede realizar para evitar la coelución del anticuerpo, pero esto puede reducir la producción del antígeno objetivo.
‡ Obtenga más información sobre qué proteínas de unión de anticuerpos son las mejores para su anticuerpo de IP.
† El entrecruzamiento se puede realizar para evitar la coelución del anticuerpo, pero esto puede reducir la producción del antígeno objetivo.
‡ Obtenga más información sobre qué proteínas de unión de anticuerpos son las mejores para su anticuerpo de IP.
Elija este producto si tiene un anticuerpo biotinilado (o ligando) que reconoce su proteína
Entre las principales ventajas de utilizar un anticuerpo biotinilado con gránulos recubiertos de estreptavidina para IP se incluyen:
- Si tiene una muestra rica en IgG solubles
- Si tiene un anticuerpo recombinante que carece de regiones Fc
- Si ya tiene Dynabeads recubiertos de estreptavidina en el laboratorio
- Si necesita un gránulo compatible con espectrometría de masas (los Dynabeads con revestimiento secundario y revestimiento de epoxi también son compatibles con espectrometría de masas)
Para exista flexibilidad, hay disponibles cuatro tipos diferentes de Dynabeads acoplados con estreptavidina. Consulte la guía de selección de estreptavidina Dynabeads para ver las diferentes características.
En los últimos 25 años, se han utilizado ampliamente los Dynabeads acoplados con estreptavidina junto con un ligando biotinilado y se citan en miles de documentos para diversas aplicaciones manuales y automatizadas. La aplicación más utilizada para la estreptavidina Dynabeads es la purificación de ácidos nucleicos y los flujos de trabajo de secuenciación de última generación (NGS), pero también se utilizan para inmunoprecipitación (IP).
Elija este producto si tiene una proteína recombinante (con etiqueta de fusión)
Entre las etiquetas de fusión más populares para la expresión de proteínas recombinantes se incluyen:
- Etiqueta His: se compone de una cadena de entre seis y nueve residuos de histidina; se utiliza principalmente para la purificación mediante la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC).
- Etiqueta GST: se compone de glutatión S-transferasa (GST), una proteína completa de 211 aminoácidos (26 kDa); se usa principalmente para la purificación mediante resina de glutatión-agarosa.
- Etiqueta HA: se compone de un péptido (YPYDVPDYA) derivado de la proteína hemaglutinina (HA) de la gripe humana; los anticuerpos anti-HA inmovilizados se utilizan para inmunoprecipitar las proteínas recombinantes con etiqueta HA.
- Etiqueta c-Myc: se compone de un péptido (EQKLISEEEDL) derivado del oncogén c-myc humano (p62 c-myc); los anticuerpos anti-c-Myc inmovilizados se utilizan para inmunoprecipitar las proteínas recombinantes etiquetadas con c-Myc.
- Etiqueta FLAG: se compone de un péptido (DYKDDDDK) que es reconocido por un anticuerpo monoclonal de rata de alta afinidad inmovilizado (clon L5); se utiliza principalmente para el aislamiento de complejos de proteínas con varias subunidades, porque el proceso de purificación moderado tiende a no alterar estas interacciones.
His y GST no son verdaderas etiquetas de epítopo, porque normalmente no se purifican ni se detectan mediante anticuerpos específicos. Por el contrario, las etiquetas HA y c-Myc son verdaderas etiquetas de epítopo, porque sus únicos medios de purificación o detección es mediante anticuerpos específicos. Las etiquetas de epítopo rara vez se utilizan para la purificación a granel, pero se emplean con mayor frecuencia para la inmunoprecipitación o la coinmunoprecipitación (IP, co-IP). Sin embargo, los cuatro sistemas de etiquetas se pueden utilizar para aplicaciones de purificación o técnicas de precipitación «pulldown».
Si tiene un anticuerpo biotinilado que reconoce la proteína que desea capturar, puede crear su propio producto de afinidad con uno de estos productos.
Datos de rendimiento: Dynabeads frente a otras soluciones de IP
En esta sección se incluyen datos comparativos que muestran los resultados de Dynabeads frente a otras soluciones magnéticas, además de soluciones a base de resina. Si todavía utiliza pulpa de partícula de agarosa o Sepharose para la IP, es posible que también le interese ver estas animaciones informativas en las que se echan por tierra los 4 mitos sobre la inmunoprecipitación.
Dynabeads comparado con soluciones a base de resina
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Figura 1. Menor tiempo de protocolo y mejor rendimiento con gránulos magnéticos Dynabeads. Se utilizaron cantidades iguales de material de muestra con respecto al contenido de Ab y al volumen de lisado celular para todos los protocolos de IP según el protocolo del fabricante. Para el método basado en Dynabeads, todos los anticuerpos en la superficie de los gránulos son accesibles para una unión óptima y altamente reproducible del antígeno.
Dynabeads en comparación con las soluciones magnéticas
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Figura 2. El gránulo magnético que elija afectará a los resultados. Los gránulos magnéticos Dynabeads tienen una superficie definida para realizar la unión necesaria, sin ninguna superficie interior para atrapar ninguna proteína no deseada. (A) Los productos Dynabeads son los gránulos superparamagnéticos monodispersos más uniformes, fabricados con calidades de producto altamente controladas para permitir un alto grado de reproducibilidad. (B-D) Las partículas magnéticas de otros proveedores tienen formas y tamaños variables que atrapan las impurezas, lo que da lugar a una menor reproducibilidad y a una mayor unión inespecífica.
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Figura 3. Los datos de evaluación comparativa muestran que los productos magnéticos Dynabeads ofrecen el mejor rendimiento cuando se tiene en cuenta la combinación del máximo rendimiento y la mínima unión inespecífica. Nuestros gránulos magnéticos también cuentan con el protocolo más rápido, lo que ayuda a mejorar la vida de su laboratorio mediante la supresión de pasos innecesarios.
Tendencias en publicaciones sobre inmunoprecipitación
La tendencia en publicaciones sobre inmunoprecipitación lo dice todo. El número de publicaciones que citan el uso de gránulos magnéticos Dynabeads frente a otros productos y tecnologías para procedimientos de inmunoprecipitación se está disparando.
Citas sobre IP con Dynabeads.
Citas sobre ChIP Dynabeads.
Cada pack de inicio tiene el imán DynaMag-2. Elija el pack de inicio más adecuado para usted.
Estas combinaciones de packs permiten ahorrar entre el 21 y el 24 % en comparación con la compra por separado.
| N.º de cat. | Contiene | N.º de pruebas |
|---|---|---|
| 10013D | Proteína A Dynabeads, 2 x 1 ml + DynaMag-2 | 40 |
| 10014D | Proteína G Dynabeads, 2 x 1 ml + DynaMag-2 | 40 |
| 10015D | Proteína A Dynabeads, 1 ml Proteína G Dynabeads, 1 ml + DynaMag-2 | 40 |
| 10016D | Proteína A Dynabeads, 5 ml + DynaMag-2 | 100 |
| 10017D | Proteína G Dynabeads, 5 ml + DynaMag-2 | 100 |
| N.º de cat. | Contiene | N.º de pruebas |
|---|---|---|
| 10018D | Proteína A Dynabeads, 2 ml + DynaMag-2 + tampones de lavado y elución | 40 |
| 10019D | Proteína G Dynabeads, 2 ml + DynaMag-2 + tampones de lavado y elución | 40 |
Vídeos
Recursos
Descargas de documentos
Recursos de aprendizaje
Recursos de asistencia
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