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用小規模地分離特定蛋白質(例如免疫沉澱法, IP)或蛋白質複合體（例如免疫共沉澱, co-IP)時，使用Dynabeads和Pierce磁珠可獲得高結合力/產率、高再現性、高純度和低成本的最佳平衡。
根據全球論文發表趨勢，用Dynabeads磁珠進行免疫沉澱持續為成長最快速的實驗方法。
Dynabeads
- 低背景值－極少或無非特異性結合，不須預清除即可產出高純度蛋白質。
- 高再現性－磁珠規格相同，確保結果一致性高。
- 高靈敏度－在檢測低豐度蛋白的高敏感應用技術(如ChIP和IP)時，文獻最常使用的方法。
- 快速便利－實驗流程不須40分鐘，且無須離心或預清除步驟。
- 節省抗體－所有結合點均位於磁珠光滑的外表面，以節省珍貴的抗體，如此對每個樣品提供了經濟實惠的解決方案。
- 高靈活性－產品適用於IP、Co-IP、pull-down和ChIP等檢測；是手動及自動化流程的理想選擇。
- 自動化免疫沉澱流程－深入了解Thermo Scientific KingFisher平台如何進行全自動免疫沉澱。
如何使用Dynabeads和Pierce磁珠進行免疫沉澱
步驟1*：抗體與磁珠結合
抗體與磁珠結合。Dynabeads和Pierce磁珠預先包被protein A、protein G、抗小鼠IgG或抗兔IgG抗體，由於快速動力學，加入的抗體僅需反應10分鐘即可與磁珠結合。生物素化抗體(biotinylated antibody)也可與鏈黴親和素偶聯(streptavidin-coupled)的Dynabeads和Pierce磁珠結合使用。在磁座上對磁珠進行一次性清洗，以去除未結合的抗體。
步驟2*：將樣品添加到磁珠中
將樣品添加到磁珠中。將含有蛋白質的樣品加入已經洗滌後並帶有結合抗體的磁珠中，靜待反應10分鐘以結合感興趣的目標蛋白質。
如果是低豐度或低親和力的蛋白質，反應時間可增至1小時或放隔夜；但通常10分鐘的反應時間已足夠。
步驟3：清洗結合蛋白質的磁珠
清洗結合蛋白質的磁珠。為維持結合目標蛋白質的高純度，在磁座上用緩衝液清洗磁珠2至4次，以去除所有未結合的蛋白質。此高效分離過程確保了高訊噪比。
第 4 步：洗脫蛋白質
洗脫蛋白質。如有需求，可透過溫和的洗脫程序或變性洗脫程序將蛋白質從磁珠上沖洗下來(詳見下列的洗脫說明)。
*Pierce磁珠可執行相同步驟，但完成總反應時間略長。
Click image to enlargeThis procedure is simple, fast, requires no preclearing step, and results in high-target protein purity, yield, and consistent results.
在您的免疫沉澱實驗使用Thermo Scientific磁珠。用磁珠進行免疫沉澱過程的動圖。
使用Dynabeads或Pierce磁珠進行不同程度的洗脫
磁珠上的重組protein A和/或protein G因不含白蛋白(albumin)的結合位點，所以避免因共同純化而造成的污染。抗體與磁珠在溶液中結合是一種平衡反應。為了盡量獲取較多抗體，應保持少量反應體積以維持高濃度的磁珠和抗體。無須預處理樣品(即使是黏稠樣品)，因此不需對樣品或磁珠進行稀釋。如果擔心樣品中抗體濃度非常低，可以增加磁珠的使用量。
使用Thermo Scientific Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP試劑盒，是從磁珠上洗脫抗體的另一選擇。
為了防止發生共洗脫，可以在免疫沉澱之前將抗體與磁珠上的protein A/G交叉聯結。
這一步驟對於若要在SDS-PAGE後續進行自動放射顯影術或Western Bloggint是非必要的，而對於銀染或考馬斯亮藍染色(coomassie dye)時則為選擇性步驟。
為您的實驗尋找合適的免疫沉澱產品
如果您具有可識別目標蛋白的抗體，請選擇此項
後續實驗將會影響您要挑選的已結合抗體產品。
已結合抗體的產品是最常用的方法，您的目標抗體與磁珠將直接結合、或與磁珠表面上預包被的配體(ligand)間接結合。
抗體結合產品選擇指南
| Protein A, G, A/G | Secondary antibodies (anti-mouse, anti-rabbit) | Surface-activated beads | |
|---|---|---|---|
| Products | Beads only:Kits: | Beads only: | Beads only:Kits: |
| Binding properties | Non-covalent antibody binding | Non-covalent antibody binding | Covalent antibody binding |
| Antibody co-eluted off the beads | Yes† | Yes† | No |
| Type of ligand | Different ligands bind different species and antibody subclasses with different specificity‡ | Anti-mouse binds mouse IgG1, IgG2a, IgG2b; anti-rabbit binds all rabbit IgGs | All antibodies |
| Mass spec compatible | Yes (Pierce MS-Compatible Magnetic IP Kit, protein A/G) Not validated (Protein A, G) | No | Yes |
| Nonspecific binding | Low | Low | Ultra-low |
* 表面活化Dynabeads磁珠－適用於結合和捕獲更多標靶，查看更多Dynabeads相關產品。
† 交叉聯結(Crosslinking)可以避免抗體的共洗脫，但會降低目標抗原的產量。
‡ 了解哪一個已結合抗體的蛋白質是您免疫沉澱抗體的最佳選擇。
如果您已經有可識別目標蛋白的生物素化抗體(或配體)，請選擇此項
磁珠的主要優勢：
- 如果您的樣品富含可溶性的IgG
- 如果您的重組抗體缺少Fc區域
- 如果您需要可兼容於質譜分析的磁珠
為提高靈活性，我們提供四種和鏈黴親和素(streptavidin)偶聯的 Dynabeads磁珠。請於Dynabeads鏈黴親和素選擇指南中查閱不同的特性。
在過去的25年中，鏈黴親和素偶聯的Dynabeads與生物素(biotin)化配體相結合，廣泛存在多種手動和自動化應用，論文引用已破數千次。鏈黴親和素偶聯的Dynabeads最廣泛應用領域是在核酸純化及次世代定序(NGS)等工作流程，然而其亦可用於免疫沉澱實驗(IP)。
如果您具有重組(融合標籤)蛋白，請選擇此項
適用重組蛋白表達的熱門融合標籤包括：
- His標籤－由6至9個組胺酸殘基串聯組成；主要透過固定化金屬離子親和層析(IMAC)進行純化。
- GST標籤－由穀胱甘肽S-轉移酵素(GST)組成，完整蛋白質包括211個胺基酸(26 kDa)；主要透過穀胱甘肽瓊脂糖樹脂純化。
- HA標籤－由人類流感血凝素(HA)蛋白質的胜肽片段(YPYDVPDYA)組成；固定化抗HA抗體可用於對HA標記的重組蛋白進行免疫沉澱實驗。
- c-Myc標籤－由人類c-myc致癌基因(p62 c-myc)的胜肽片段 (EQKLISEEDL)組成；固定化抗c-Myc抗體可用於對c-Myc標記的重組蛋白進行免疫沉澱實驗。
- FLAG標籤－由胜肽片段(DYKDDDDK)組成，可由固定化高親和力大鼠單株抗體(clone L5)識別；主要用途為分離具多個次單元的蛋白質複合體，因為純化過程溫和而不至於破壞之間的交互作用。
His和GST並非真正的表位標籤，因為其通常不是透過特異性抗體進行純化或檢測。相較之下，HA和c-Myc標籤是真正的表位標籤，因為它們只能透過特異性抗體進行純化或檢測。表位標籤很少用於批量純化，但經常用於免疫沉澱或免疫共沉澱。然而，以上四種標籤系統均可用於純化或pull-down技術應用。
基準測試：比較Dynabeads與其他免疫沉澱解決方案。
Dynabeads在免疫沉澱(IP)性能持續超越其他方法或磁珠解決方案。還在使用Sepharose或瓊脂糖珠漿(agarose bead slurry)嗎?查看關於免疫沉澱的常見迷思。
Dynabeads與樹脂解決方案的比較
點擊圖片放大
圖1. Dynabeads磁珠具有更短的操作時間和更高的產量。根據製造商的操作手冊，採取與抗體及細胞裂解物等量的樣品材料進行免疫沉澱實驗。
結果顯示使用Dynabeads方法，所有磁珠表面的抗體均能有效地與抗原結合，並獲得最佳且高再現性的結果。
Dynabeads與磁性解決方案的比較
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圖2. 您選擇的磁珠將影響結果。Dynabeads磁珠的表面清晰可完成有效結合，且不會有內層捕獲不想要蛋白質的狀況。(A) Dynabeads產品用的是一致性最佳、單顆、超順磁性的磁珠，生產品質嚴格管控以達高再現性。(B－D) 顯示其他供應商的磁性顆粒形狀和尺寸不一且容易捕獲雜質，導致較低的再現性並增加非特異性結合。
點擊圖片放大
圖3. 參考基準測試數據，顯示Dynabeads磁性產品的表現性能最佳、產量最高且非特異性結合最少。我們的磁珠同時省略不必要的操作步驟，以最快的流程改善您的實驗室生活。
使用KingFisher儀器進行自動化免疫沉澱。
在KingFisher儀器上使用Dynabeads和Pierce磁珠，進行直接或間接免疫沉澱實驗。
Dynabeads
- 低背景值－極少或無非特異性結合，不須預清除即可產出高純度蛋白質。
- 高再現性－磁珠規格相同，確保結果一致性高。
- 高靈敏度－在檢測低豐度蛋白的高敏感應用技術(如ChIP和IP)時，文獻最常使用的方法。
- 快速便利－實驗流程不須40分鐘，且無須離心或預清除步驟。
- 節省抗體－所有結合點均位於磁珠光滑的外表面，以節省珍貴的抗體，如此對每個樣品提供了經濟實惠的解決方案。
- 高靈活性－產品適用於IP、Co-IP、pull-down和ChIP等檢測；是手動及自動化流程的理想選擇。
- 自動化免疫沉澱流程－深入了解Thermo Scientific KingFisher平台如何進行全自動免疫沉澱。
如何使用Dynabeads和Pierce磁珠進行免疫沉澱
步驟1*：抗體與磁珠結合
抗體與磁珠結合。Dynabeads和Pierce磁珠預先包被protein A、protein G、抗小鼠IgG或抗兔IgG抗體，由於快速動力學，加入的抗體僅需反應10分鐘即可與磁珠結合。生物素化抗體(biotinylated antibody)也可與鏈黴親和素偶聯(streptavidin-coupled)的Dynabeads和Pierce磁珠結合使用。在磁座上對磁珠進行一次性清洗，以去除未結合的抗體。
步驟2*：將樣品添加到磁珠中
將樣品添加到磁珠中。將含有蛋白質的樣品加入已經洗滌後並帶有結合抗體的磁珠中，靜待反應10分鐘以結合感興趣的目標蛋白質。
如果是低豐度或低親和力的蛋白質，反應時間可增至1小時或放隔夜；但通常10分鐘的反應時間已足夠。
步驟3：清洗結合蛋白質的磁珠
清洗結合蛋白質的磁珠。為維持結合目標蛋白質的高純度，在磁座上用緩衝液清洗磁珠2至4次，以去除所有未結合的蛋白質。此高效分離過程確保了高訊噪比。
第 4 步：洗脫蛋白質
洗脫蛋白質。如有需求，可透過溫和的洗脫程序或變性洗脫程序將蛋白質從磁珠上沖洗下來(詳見下列的洗脫說明)。
*Pierce磁珠可執行相同步驟，但完成總反應時間略長。
Click image to enlargeThis procedure is simple, fast, requires no preclearing step, and results in high-target protein purity, yield, and consistent results.
在您的免疫沉澱實驗使用Thermo Scientific磁珠。用磁珠進行免疫沉澱過程的動圖。
使用Dynabeads或Pierce磁珠進行不同程度的洗脫
磁珠上的重組protein A和/或protein G因不含白蛋白(albumin)的結合位點，所以避免因共同純化而造成的污染。抗體與磁珠在溶液中結合是一種平衡反應。為了盡量獲取較多抗體，應保持少量反應體積以維持高濃度的磁珠和抗體。無須預處理樣品(即使是黏稠樣品)，因此不需對樣品或磁珠進行稀釋。如果擔心樣品中抗體濃度非常低，可以增加磁珠的使用量。
使用Thermo Scientific Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP試劑盒，是從磁珠上洗脫抗體的另一選擇。
為了防止發生共洗脫，可以在免疫沉澱之前將抗體與磁珠上的protein A/G交叉聯結。
這一步驟對於若要在SDS-PAGE後續進行自動放射顯影術或Western Bloggint是非必要的，而對於銀染或考馬斯亮藍染色(coomassie dye)時則為選擇性步驟。
為您的實驗尋找合適的免疫沉澱產品
如果您具有可識別目標蛋白的抗體，請選擇此項
後續實驗將會影響您要挑選的已結合抗體產品。
已結合抗體的產品是最常用的方法，您的目標抗體與磁珠將直接結合、或與磁珠表面上預包被的配體(ligand)間接結合。
抗體結合產品選擇指南
| Protein A, G, A/G | Secondary antibodies (anti-mouse, anti-rabbit) | Surface-activated beads | |
|---|---|---|---|
| Products | Beads only:Kits: | Beads only: | Beads only:Kits: |
| Binding properties | Non-covalent antibody binding | Non-covalent antibody binding | Covalent antibody binding |
| Antibody co-eluted off the beads | Yes† | Yes† | No |
| Type of ligand | Different ligands bind different species and antibody subclasses with different specificity‡ | Anti-mouse binds mouse IgG1, IgG2a, IgG2b; anti-rabbit binds all rabbit IgGs | All antibodies |
| Mass spec compatible | Yes (Pierce MS-Compatible Magnetic IP Kit, protein A/G) Not validated (Protein A, G) | No | Yes |
| Nonspecific binding | Low | Low | Ultra-low |
* 表面活化Dynabeads磁珠－適用於結合和捕獲更多標靶，查看更多Dynabeads相關產品。
† 交叉聯結(Crosslinking)可以避免抗體的共洗脫，但會降低目標抗原的產量。
‡ 了解哪一個已結合抗體的蛋白質是您免疫沉澱抗體的最佳選擇。
如果您已經有可識別目標蛋白的生物素化抗體(或配體)，請選擇此項
磁珠的主要優勢：
- 如果您的樣品富含可溶性的IgG
- 如果您的重組抗體缺少Fc區域
- 如果您需要可兼容於質譜分析的磁珠
為提高靈活性，我們提供四種和鏈黴親和素(streptavidin)偶聯的 Dynabeads磁珠。請於Dynabeads鏈黴親和素選擇指南中查閱不同的特性。
在過去的25年中，鏈黴親和素偶聯的Dynabeads與生物素(biotin)化配體相結合，廣泛存在多種手動和自動化應用，論文引用已破數千次。鏈黴親和素偶聯的Dynabeads最廣泛應用領域是在核酸純化及次世代定序(NGS)等工作流程，然而其亦可用於免疫沉澱實驗(IP)。
如果您具有重組(融合標籤)蛋白，請選擇此項
適用重組蛋白表達的熱門融合標籤包括：
- His標籤－由6至9個組胺酸殘基串聯組成；主要透過固定化金屬離子親和層析(IMAC)進行純化。
- GST標籤－由穀胱甘肽S-轉移酵素(GST)組成，完整蛋白質包括211個胺基酸(26 kDa)；主要透過穀胱甘肽瓊脂糖樹脂純化。
- HA標籤－由人類流感血凝素(HA)蛋白質的胜肽片段(YPYDVPDYA)組成；固定化抗HA抗體可用於對HA標記的重組蛋白進行免疫沉澱實驗。
- c-Myc標籤－由人類c-myc致癌基因(p62 c-myc)的胜肽片段 (EQKLISEEDL)組成；固定化抗c-Myc抗體可用於對c-Myc標記的重組蛋白進行免疫沉澱實驗。
- FLAG標籤－由胜肽片段(DYKDDDDK)組成，可由固定化高親和力大鼠單株抗體(clone L5)識別；主要用途為分離具多個次單元的蛋白質複合體，因為純化過程溫和而不至於破壞之間的交互作用。
His和GST並非真正的表位標籤，因為其通常不是透過特異性抗體進行純化或檢測。相較之下，HA和c-Myc標籤是真正的表位標籤，因為它們只能透過特異性抗體進行純化或檢測。表位標籤很少用於批量純化，但經常用於免疫沉澱或免疫共沉澱。然而，以上四種標籤系統均可用於純化或pull-down技術應用。
基準測試：比較Dynabeads與其他免疫沉澱解決方案。
Dynabeads在免疫沉澱(IP)性能持續超越其他方法或磁珠解決方案。還在使用Sepharose或瓊脂糖珠漿(agarose bead slurry)嗎?查看關於免疫沉澱的常見迷思。
Dynabeads與樹脂解決方案的比較
點擊圖片放大
圖1. Dynabeads磁珠具有更短的操作時間和更高的產量。根據製造商的操作手冊，採取與抗體及細胞裂解物等量的樣品材料進行免疫沉澱實驗。
結果顯示使用Dynabeads方法，所有磁珠表面的抗體均能有效地與抗原結合，並獲得最佳且高再現性的結果。
Dynabeads與磁性解決方案的比較
點擊圖片放大
圖2. 您選擇的磁珠將影響結果。Dynabeads磁珠的表面清晰可完成有效結合，且不會有內層捕獲不想要蛋白質的狀況。(A) Dynabeads產品用的是一致性最佳、單顆、超順磁性的磁珠，生產品質嚴格管控以達高再現性。(B－D) 顯示其他供應商的磁性顆粒形狀和尺寸不一且容易捕獲雜質，導致較低的再現性並增加非特異性結合。
點擊圖片放大
圖3. 參考基準測試數據，顯示Dynabeads磁性產品的表現性能最佳、產量最高且非特異性結合最少。我們的磁珠同時省略不必要的操作步驟，以最快的流程改善您的實驗室生活。
使用KingFisher儀器進行自動化免疫沉澱。
在KingFisher儀器上使用Dynabeads和Pierce磁珠，進行直接或間接免疫沉澱實驗。
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免疫沉澱論文發表趨勢
The publication trend for immunoprecipitation says it all. The number of publications citing the use of Dynabeads magnetic beads vs. other technologies and products for immunoprecipitation procedures is skyrocketing.
Dynabeads IP citations.
Dynabeads ChIP citations.
- Brinkmalm A, Öhrfelt A, Bhattacharjee P, Zetterberg H. Detection of α-Synuclein in Biological Samples Using Mass Spectrometry.Methods Mol Biol. 2019;1948:209-220. doi: 10.1007/978-1-4939-9124-2_16.
- Cicognola C, Brinkmalm G, Wahlgren J, Portelius E, Gobom J, Cullen NC, Hansson O, Parnetti L, Constantinescu R, Wildsmith K, Chen HH, Beach TG, Lashley T, Zetterberg H, Blennow K, Höglund K. Novel tau fragments in cerebrospinal fluid: relation to tangle pathology and cognitive decline in Alzheimer's disease.Acta Neuropathol. 2019 Feb;137(2):279-296. doi: 10.1007/s00401-018-1948-2. Epub 2018 Dec 13.
- Gkanatsiou E, Portelius E, Toomey CE, Blennow K, Zetterberg H, Lashley T, Brinkmalm G. A distinct brain beta amyloid signature in cerebral amyloid angiopathy compared to Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 2019 May 14;701:125-131. doi: 10.1016/j.neulet.2019.02.033. Epub 2019 Feb 23.
- Kvartsberg H, Lashley T, Murray CE, Brinkmalm G, Cullen NC, Höglund K, Zetterberg H, Blennow K, Portelius E. The intact postsynaptic protein neurogranin is reduced in brain tissue from patients with familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 2019 Jan;137(1):89-102. doi: 10.1007/s00401-018-1910-3. Epub 2018 Sep 22.
- Öhrfelt A, Brinkmalm A, Dumurgier J, Brinkmalm G, Hansson O, Zetterberg H, Bouaziz-Amar E, Hugon J, Paquet C, Blennow K. The pre-synaptic vesicle protein synaptotagmin is a novel biomarker for Alzheimer's disease.Alzheimers Res Ther. 2016 Oct 3;8(1):41.
短片
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應用指南
學習資源
支援資源
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.