蛋白質-蛋白質交互作用(Protein-Protein Interaction)分析概述

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蛋白質是細胞內促進大部分生物過程的主力軍，包含基因表達、細胞生長、增殖、營養吸收、細胞形態、移動性、細胞間通訊和細胞凋亡等。但是細胞會對無數的刺激做出反應，因此蛋白質的表達是一個動態過程；完成特定任務的蛋白質，可能並不會持續表達或活化。此外，因為許多蛋白質是以細胞類型為基礎來進行表達，而並非所有細胞都相等。蛋白質的這些基本特徵暗示著其難以研究的複雜性，尤其是在特定生物背景下嘗試理解蛋白質功能。

有助於了解蛋白質功能的關鍵觀點，包括：

• 蛋白質序列與結構—探索結構模體（Motif），以預測蛋白質功能。
• 進化歷程與保留序列—鑑定關鍵調控殘基。
• 基因表達譜—剖析細胞類型的特異性，以及如何調節表達。
• 轉譯後修飾—磷酸化（Phosphorylation）、醯化（Acylation）、醣基化（Glycosylation）和泛素化（Ubiquitination）以表明其位置、激活和/或功能。
• 與其他蛋白質的交互作用—透過了解其結合蛋白的功能，推測其潛在功能。
• 細胞內定位—可能暗示蛋白質的功能。

直到1990年代末期，對於蛋白質功能的分析主要聚焦於單一種蛋白質。然而，由於大多數蛋白質與其他蛋白質進行交互作用以發揮正常功能，因此應該在成群發生交互作用的情境下對其進行研究，才能充分了解它們的功能。隨著人類基因組的公開和蛋白質體學領域的蓬勃發展，了解蛋白質如何交互作用並鑑定生物網絡，對於理解蛋白質如何在細胞內執行功能極為關鍵。

蛋白質交互作用的基本特徵可以是穩定或短暫的，且這兩種類型的交互作用力可能很強或是微弱。蛋白質純化成多次單元複合體的相關交互作用大部分很穩定，這些複合體的次單元可以相同，也可以不同。血紅蛋白和core RNA聚合酶是透過多次單元交互作用所形成穩定複合體的實例。

暫態交互作用被認為可掌控大多數的細胞過程。顧名思義，暫態交互作用的本質是暫時的，通常需要一套完整條件以促進交互作用，例如磷酸化、構象改變或定位於細胞內部的離散區域。暫態交互作用可以很強或微弱、快速或緩慢。在與它們的結合物接觸時，暫態交互作用的蛋白質參與了廣泛的細胞過程，包括蛋白質修飾、運輸、折疊、訊息傳導、細胞凋亡以及細胞週期等。下面的圖闡釋了，關於調節細胞凋亡和抗凋亡過程的蛋白質交互作用。

Heavy BAD蛋白質-蛋白質交互作用。圖A：使用穀胱甘肽樹脂(E1)和鈷樹脂(E2)串聯親和力，從HeLa IVT裂解物(L)中純化出的重組輕質和重質BAD-GST-HA-6xHIS的SDS-PAGE凝膠，並進行Coomassie染色。每個cloumn標示出其流通量(FT)。圖B：細胞存活和細胞死亡（即細胞凋亡）期間，BAD磷酸化和蛋白質交互作用的示意圖。圖C：BAD蛋白質序列的涵蓋範圍，顯示已確定的Akt磷酸化共有位點（紅色框）。圖D：穩定態同位素標記BAD胜肽HSSYPAGTEDDEGmGEEPSPFr的MS光譜。

蛋白質透過疏水性鍵結、van der Waals作用力和鹽橋等組合，在每個蛋白質的特定結合結構域上相互結合。這些結構域可以是小型結合裂縫或大型表面，長度可能僅數個胜肽或跨越數百個胺基酸。結合的強度受結合結構域大小的影響。舉亮胺酸拉鍊（Leucine zipper）為例，它是一個常見的、可促進穩定的protein-protein interaction的表面結構域，是每個蛋白質皆由α-螺旋組成，透過每個α-螺旋上規則間隔的亮胺酸殘基的疏水性鍵，在相鄰的螺旋肽鏈之間以平行方式相互牽引而結合。由於緊密的分子堆積，亮胺酸拉鍊為多重蛋白複合體提供了穩定的結合，儘管由於α-螺旋中的非亮胺酸胺基酸會減少分子堆積而降低交互作用的強度，因此，所有亮胺酸拉鍊的結合方式並不完全相同。

兩個Src同源（SH）結構域，SH2和SH3，是暫態結合結構域的常見例子，它們與短胜肽序列結合並且普遍存在於訊息傳遞蛋白中。SH2結構域可識別具有磷酸化酪胺酸殘基（Phosphorylated tyrosine residue）的胜肽序列，這通常表示蛋白質的活化。SH2結構域在生長因子受體的訊息傳導中扮演關鍵角色，在此過程中，酪胺酸殘基上發生配體介導受體的磷酸化，使下游反應物聚集，並透過殘基的SH2結構域對其進行識別。SH3結構域可用於識別富含脯胺酸（Proline）的胜肽序列，通常被激酶、磷脂酶和GTP酶用來鑑定目標蛋白。儘管SH2和SH3結構域通常會與這些模體（Motif）相結合，但不同蛋白質交互作用的特異性，是由各自模體中鄰近的胺基酸殘基所決定。

兩種或多種蛋白質與特定功能目標交互作用的結果，可以運用數種不同的方式來證明。蛋白質交互作用造成的可觀測效應，已整理概列如下：

• 酶的動力學特性改變，這可能是由於受質結合或異位效應（allosteric effect）的細微變化所導致。
• 透過受質在結構域或次單元間的移動來實現受質傳遞，最後形成預期的最終產品。
• 創造一個全新的結合位點，通常用於小效應分子。
• 蛋白質失去活性或被破壞。
• 透過與不同結合物的交互作用，改變一個蛋白質對其受質的特異性；例如，呈現一種全新功能，而且兩種蛋白質都無法單獨表現這項新功能。
• 在上游或下游程序中發揮調節作用。

蛋白質交互作用的驗證、特徵描述和確認，通常需要整合多種技術來進行。之前對於未知蛋白質，可以透過它們與一種或多種已知蛋白質的關聯性來探索。蛋白質交互作用分析還可能於眾所周知的蛋白質上，揭露出獨特且未曾預見的功能作用。對交互作用進行探索或驗證的第一步，是了解這些蛋白質位於體內何處、如何、在何種條件下交互作用，以及這些交互作用的功能意義。

雖然有各式各樣的方法和途徑研究蛋白質-蛋白質交互作用，無法在此處描述，但下表和本節的其餘部分重點介紹了分析蛋白質-蛋白質交互作用的常用方法，以及使用每種方法適合研究的交互作用類型。綜上所述，穩定的蛋白質-蛋白質交互作用最容易透過免疫共沉澱和下拉測定等物理方法分離，因為蛋白質複合體不會隨著時間而分解。使用這些方法可以鑑定微弱或短暫的交互作用，在Co-IP或下拉期間，先將蛋白質共價交聯以凍結交互作用。另外，交聯作用，連同標記轉移和遠西方墨點分析可以獨立於其他方法，來鑑定蛋白質-蛋白質交互作用。

免疫共沉澱（Co-IP）是一種用以探索蛋白質交互作用的受歡迎技術。Co-IP方法與單一蛋白質的免疫沉澱（IP）基本相同，不同之處在於抗體沉澱的目標蛋白，也稱為"誘餌（bait）"，將與來自裂解物的結合物/蛋白質複合體，或稱"獵物（prey）"，進行共沉澱反應。實際上，交互作用的蛋白質與目標抗原結合，而目標抗原則與固定在載體上的抗體結合。免疫沉澱蛋白及其結合目標，通常會使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和西方墨點分析來檢測。當關聯蛋白共沉澱時，最常見的假設是在細胞層級上，這些蛋白質與目標抗原的功能有關。然而這僅是假設，有待進一步驗證。

細胞週期蛋白B和Cdk1的免疫共沉澱。Thermo Scientific Pierce蛋白A/G磁珠與Cdk1複合體上的Cdk1抗體結合。Cyclin B與Cdk1結合，之後與其結合物一同被捕獲。

下拉測定在方法學上與免疫共沉澱相似，因為本方法利用磁珠載體來純化交互作用的蛋白質。然而，這兩種方法的區別在於，Co-IP使用抗體來捕獲蛋白質複合體，而下拉測定則使用"誘餌（bait）"蛋白來純化裂解物中與誘餌結合的任何蛋白質。下拉測定非常適合研究作用力強或穩定的交互作用，或是無可用抗體以執行免疫共沉澱的交互作用。

下拉測定的常規示意圖。下拉測定是一種類似於免疫沉澱的小規模親和純化技術，不同之處在於抗體被其他親和系統所取代。在這種情況下，親和系統包括穀胱甘肽-S-轉移酶（GST）-、聚組胺酸-或鏈黴親和素標記的蛋白質或結合域，可分別被穀胱甘肽-、金屬螯合物（鈷或鎳）-或生物素包被的瓊脂糖微珠所捕獲。固定的融合標籤蛋白作為"誘餌"來捕獲假定的結合物（即"獵物"）。在典型的下拉測定中，固定的誘餌蛋白質與細胞裂解物一起作用，在規定的洗滌步驟後，使用競爭性分析物、或低pH值、或還原性緩衝液選擇性地洗脫複合體，再進行凝膠或西方墨點分析。

大多數蛋白質-蛋白質交互作用是暫態的，僅在細胞內發生單一級聯或其他代謝功能中短暫出現。交聯交互作用的蛋白質，是一種讓交互作用複合體組成相當穩定或永久連接的方法。一旦交互作用的組成形成共價交聯，其他步驟（如細胞裂解、親和純化、電泳或質譜）即可用來分析蛋白質-蛋白質交互作用，同時可維持原有的交互作用複合體。

可以將同型雙功能的胺反應交聯劑添加到細胞中，以將可能交互作用的蛋白質交聯在一起，然後於裂解後透過Western blotting進行分析。交聯劑可以是膜穿透性的，如DSS，用於交聯細胞內蛋白質，或也可以是膜不通透性的，如BS3，用於交聯細胞表面蛋白質。此外，一些交聯劑可以使用還原劑（如DSP或DTSSP）裂解，用於逆轉交聯。

另外，含有光活化基團的異型雙功能交聯劑，如SDA產品或Sulfo-SDA，可用於捕捉可能發生的暫態交互作用，例如在特定刺激之後。光活化的使用時機，也可以在以光活化胺基酸L-Photo-Leucine或L-Photo-Methionine進行代謝標記之後。

蛋白質之間的交聯位點可以利用質譜法進行高精度繪製，特別是當使用MS可裂解交聯劑（如DSSO或DSBU）時。

標記轉移作用，過程包括交互作用分子（即誘餌和獵物蛋白質）與標記的交聯劑產生交聯，然後切斷誘餌和獵物之間的連接，使標記保持附著於獵物上。這種方法極具特殊價值，因為它能夠鑑定與感興趣蛋白質產生微弱或暫態交互作用的蛋白質。因全新的非同位素試劑和方法持續開發中，讓這項技術更容易被研究人員所接受，且能輕鬆地執行。

Sulfo-SBED生物素標記轉移和Western blotting分析的實驗策略。

正如pull-down下拉測定與Co-IP的不同之處，是在於使用標記的蛋白質而非抗體，來檢測蛋白質-蛋白質交互作用。Far-western分析也與Western blot分析不同，在於蛋白質-蛋白質交互作用的檢測，是透過電泳中的蛋白質與經純化且標記的誘餌蛋白作用，而不是使用目標蛋白特異性抗體。採用"Far"一詞以強調其差異性。

分析蛋白質-蛋白質交互作用的遠西方墨點圖。在此圖例中，使用標記的誘餌蛋白以探測轉印膜或凝膠中的獵物蛋白。一旦結合，以誘餌標籤為目標的酶（辣根過氧化物酶；HRP）結合抗體，被用來標記交互作用，然後透過酶化學發光檢測。這種通用方法可以透過未標記的誘餌蛋白（利用抗體檢測）、生物素化的誘餌蛋白（利用酶共軛的鏈黴親和素檢測），或放射性標記的誘餌蛋白（於底片曝光檢測）來適應調整。

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2. Phizicky EM, Fields S (1995) Protein-protein interactions: Methods for detection and analysis. Microbiol Rev 59:94–123.