¿Qué es HPLC?
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Funcionamiento de la HPLC
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La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) es una técnica de química analítica muy amplia que se utiliza para separar compuestos en una mezcla de sustancias químicas. Para realizar estas separaciones, se hace uso del caudal de una fase móvil que pasa a presión a través de una columna empaquetada con una fase estacionaria.

La fase móvil transporta una muestra líquida a través de la columna hasta el detector y los compuestos o analitos se separan debido a los distintos grados de interacción con la fase estacionaria.

El detector mide los analitos después de la elución de la columna, y un sistema de datos de cromatografía (CDS) traduce la señal que se ha detectado. 

Los datos traducidos del análisis mediante HPLC se presentan en un cromatograma, donde el eje «x» es una medida del tiempo y el eje «y» mide una señal específica generada por el detector.    

Analito: compuesto(s) de interés para la detección mediante análisis de HPLC

Fase móvil: fase en movimiento compuesta por disolventes o eluyentes que fluyen desde que se introducen hasta que finaliza la detección 

Fase estacionaria: fase fija en la que se produce la separación física de los analitos

Caudal: rapidez a la que fluye la fase móvil con respecto al tiempo

Tiempo de retención: tiempo entre la inyección de las muestras y la señal de picos máxima del analito en un cromatograma

Eficacia: expresada como el número de placas teóricas, una medida clave para cuantificar la eficacia de una separación    

Resolución: capacidad para distinguir entre picos y el principal aspecto que tener en cuenta en cualquier separación 

Selectividad: capacidad para separar dos analitos

Volumen de vacío: todo el volumen de una columna que no está ocupado por la fase estacionaria

Límite de detección: cantidad más pequeña de un analito que se puede detectar de forma fiable

Límite de cuantificación: cantidad mínima o máxima de un analito que se puede cuantificar de forma fiable

¿Quién inventó la HPLC?

Mikhail Semyonovich Tsvet es a quien se le reconoce por la invención de la cromatografía de líquidos con columnas. En 1901, presentó un método de cromatografía de adsorción para separar los pigmentos vegetales con éter de petróleo en un tubo de vidrio estrecho y lleno de carbonato de calcio. Tsvet publicó su trabajo en 1903 y probó 126 adsorbentes en polvo diferentes. Fue la primera persona en utilizar el término «cromatografía» en sus artículos publicados en 1906.

40 años más tarde, en 1941, Archer John Porter Martin y Richard Lawrence Millington Synge publicaron un nuevo tipo de cromatografía de partición que utilizaba gel de sílice en las columnas para mantener el agua inmóvil mientras el cloroformo fluía a través de la columna con el fin de separar los aminoácidos.

Este experimento fue el comienzo del desarrollo de la HPLC, aunque aún se necesitarían 30 años más para empezar a utilizar bombas que empujaran la fase líquida a través de la columna empaquetada.

En la actualidad, laboratorios de todo el mundo utilizan la HPLC para identificar y cuantificar componentes químicos no volátiles y semivolátiles en muestras líquidas.

Un instrumento de HPLC tiene cuatro componentes principales: una bomba para empujar la fase móvil, un muestreador automático para inyectar la muestra, una columna con fase estacionaria para separar los compuestos de la muestra y un detector para medir los compuestos. También hay otros elementos como los capilares y los tubos de conexión, que permiten el flujo continuo de la fase móvil y la muestra a través del sistema, así como un paquete de CDS para llevar un control del instrumento de HPLC, la separación, la detección y la evaluación de resultados.

Cada análisis mediante HPLC incluye los siguientes pasos:

  1. Inicio de la fase móvil. La bomba empuja los eluyentes o disolventes a través del sistema a un caudal específico.

  2. Inyección de la muestra. Una vez se ha inyectado la muestra en la trayectoria de flujo de la fase móvil, esta se desplaza junto con la fase móvil desde el punto de inyección hasta la cabeza de la columna.

  3. Separación de los compuestos. La separación física de los compuestos ocurre en la fase estacionaria de la columna. Después de la elución de la columna, los componentes separados de la muestra viajan hasta el detector.

  4. Detección de los analitos. Se detectan los analitos de interés en función de la señal eléctrica generada por las propiedades específicas.

  5. Generación del cromatograma. La señal detectada del analito por el CDS se traduce en un cromatograma donde aparece la señal del analito en relación al tiempo.

Factores que afectan a las separaciones en la HPLC

Hay muchos factores que influyen en las separaciones mediante HPLC, como la composición de la fase móvil, la composición química de la fase estacionaria o la temperatura. La separación solo se realiza correctamente si los analitos tienen afinidades diferentes por la fase estacionaria, por lo que es crucial seleccionar la fase estacionaria adecuada para sus compuestos. Estos son los principales factores que influyen en el proceso general de separación: 

  • Propiedades fisicoquímicas del analito, como el tamaño, la carga, la polaridad y la volatilidad
  • Propiedades fisicoquímicas de la fase estacionaria, como la polaridad, la carga y la viscosidad
  • Propiedades fisicoquímicas de la fase móvil y su interacción con el analito y las fases estacionarias

 

¿Separaciones isocráticas o de gradientes?

Todas las separaciones de la HPLC se realizan con uno de estos dos métodos: isocrático o de gradiente.  

En los métodos isocráticos las separaciones se realizan mediante el uso durante el análisis de un eluyente de composición uniforme, como acetonitrilo al 100 % o una mezcla 50:50 de acetonitrilo y agua.

Por su parte, en los métodos de gradiente hay cambios en la composición de la fase móvil durante el proceso de separación. Estos métodos suelen emplear dos disolventes, denominados A y B. El ciclo comenzará con un cierto porcentaje de A frente a B como, por ejemplo, un 60 % de agua frente a un 40 % de acetonitrilo. A continuación el porcentaje de los disolventes irá cambiando a lo largo de la separación.

Las separaciones de gradientes suelen ofrecer un rendimiento superior a los métodos isocráticos, pero son más complejas y requieren un hardware de bomba avanzado. 

Dado el infinito número de compuestos y la diversidad estructural de los analitos potenciales, la HPLC no suele ser una solución estándar para todos los procedimientos. Desde las separaciones a nanoescala hasta las separaciones preparativas, a continuación se presenta una lista de los tipos de técnicas de HPLC más comunes y cuándo aplicar cada una.

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento

Los métodos de cromatografía de líquidos de alto rendimiento se utilizan con partículas de fase estacionaria de entre 3 y 5 µm y alcanzan presiones de funcionamiento de hasta 600 bar a caudales de entre 1 y 2 mL/min. La HPLC estándar es el tipo de cromatografía de líquidos más utilizada en los distintos sectores.

  • Las aplicaciones rutinarias de HPLC incluyen el aseguramiento y control de calidad de moléculas pequeñas y grandes de productos farmacéuticos, productos químicos industriales y productos de seguridad alimentaria.
Cromatografía de líquidos de rendimiento ultralto

Cromatografía de líquidos de rendimiento ultralto

Los métodos de cromatografía de líquidos de rendimiento ultralto (UHPLC) se utilizan con partículas de fase estacionaria de <2 µm y alcanzan presiones de funcionamiento de entre 600 y 1200 bar a caudales de entre 0,2 y 0,7 mL/min. Este mayor intervalo de presión ofrece mejor resolución y sensibilidad, mayor capacidad de procesamiento y menor uso de disolventes que los sistemas de HPLC estándar. La UHPLC amplía las posibilidades de la HPLC tradicional al permitir que los usuarios utilicen partículas y columnas de menor diámetro interior y finalicen los análisis más rápidamente.

  • Entre las aplicaciones típicas de la UHPLC destacan las aplicaciones en laboratorios de investigación y desarrollo y en los ámbitos de farmacia y biofarmacia para el desarrollo y la caracterización de péptidos, anticuerpos y fármacos de moléculas pequeñas.
Cromatografía de líquidos y espectrometría de masas

Cromatografía de líquidos y espectrometría de masas

La cromatografía de líquidos y espectrometría de masas (LC-MS) utiliza un espectrómetro de masas en lugar de un detector óptico tradicional como los detectores UV-Vis. Con este método se mide la relación entre masa y carga del analito en lugar de sus propiedades ópticas.

  • Los péptidos y proteínas se analizan de forma rutinaria con los métodos de LC-MS.
Cromatografía de líquidos de bajo caudal

Cromatografía de líquidos de bajo caudal

La cromatografía de líquidos de bajo caudal abarca rangos de nanoflujo, microflujo y flujo capilar que oscilan desde nL/min bajos hasta aproximadamente 50 µL/min y proporciona una mayor sensibilidad debido a la disminución asociada del diámetro interior de la columna, lo que conlleva una menor dilución de las bandas de los analitos. Estos análisis se combinan normalmente con la espectrometría de masas debido a la relación inversa entre el caudal y la eficacia de la ionización por electrospray, lo que mejora significativamente la sensibilidad del método.

  •  Las técnicas de bajo caudal son ideales para mediciones de alta sensibilidad de moléculas en matrices biológicas complejas en las que las concentraciones de analitos abarcan varios órdenes de magnitud.   
Cromatografía de líquidos preparativa

Cromatografía de líquidos preparativa

Las técnicas de LC preparativa implican la recogida del eluyente fraccionado en recipientes de muestras separados para aislar uno o más analitos con el fin de purificar los componentes principales o aislar impurezas para investigaciones posteriores. Las separaciones de LC preparativa se dividen en tres categorías: Analíticas, semipreparativas y preparativas, y el objetivo de la separación determina la escala,el  tamaño de la columna y el caudal.

  • Las separaciones de LC preparativa sirven para la purificación a gran escala de componentes de masas y a menudo se utilizan para fabricación. Las columnas suelen tener un diámetro interior de entre 50 y 200 mm, y funcionan a caudales de >50 mL/min. 
  • Las aplicaciones de LC semipreparativa abarcan desde la purificación a pequeña escala para la fabricación hasta los flujos de trabajo de caracterización, como el aislamiento de compuestos para el análisis de estructuras. Las columnas tienen un diámetro interior de entre 10 y 30 mm, y funcionan a caudales de entre 5 y 50 mL/min.
  • Las purificaciones a escala analítica se utilizan en procesos anteriores y posteriores, como para mejorar el rendimiento de un producto o aislar compuestos puros para caracterizaciones de criomicroscopía electrónica. Las columnas y los caudales se encuentran por debajo de 4,6 mm y 2 mL/min, respectivamente.
Cromatografía de líquidos bidimensional

Cromatografía de líquidos bidimensional

La cromatografía de líquidos bidimensional (2D-LC) es una técnica de separación avanzada que utiliza dos composiciones químicas de columna complementarias en serie para una separación multidimensional en lugar de procesar la muestra a través de una sola columna. Los cromatógrafos pueden emplear tres tipos exclusivos de métodos de 2D-LC para mejorar la resolución de las muestras gracias a la selectividad en varias columnas.

  • Las aplicaciones de la 2D-LC incluyen el uso con mezclas químicas complejas (como las vacunas o los alimentos) que tengan matrices de muestras de interferencia.

  1. 2D-LC exhaustiva La muestra completa se separa en la columna de la primera dimensión (¹D) y posteriormente se separa en una segunda columna y una segunda dimensión complementaria (²D).

  2. 2D-LC basada en bucle heart-cut. Corta automáticamente las fracciones de eluyente específicas de la columna de la primera dimensión (¹D) mediante un bucle de muestras y las transfiere a la columna complementaria de la segunda dimensión (²D).

  3. 2D-LC basada en separación heart-cut. Transfiere automáticamente una sola fracción de eluyente de la columna de la primera dimensión (¹D) a una columna de separación. Los métodos de separación permiten una concentración previa de analitos de baja abundancia y solucionan problemas de incompatibilidad de disolventes antes de que la fracción se eluya en una columna de segunda dimensión (²D) para resolver picos difíciles o de elución simultánea.

Cromatografía líquida dual

Cromatografía líquida dual

La cromatografía líquida dual es un método de HPLC multicanal que utiliza dos trayectorias de flujo independientes en un solo sistema para procesar dos análisis de forma simultánea. Estos sistemas de HPLC tienen dos bombas con dos trayectorias de disolvente independientes, dos unidades de dosificación dentro del muestreador automático y dos detectores, pero tienen el tamaño de un solo sistema de HPLC.

  • Los métodos de LC dual son útiles para cualquier situación en la que sea necesario aumentar el procesamiento de las muestras, como cuando se analiza una muestra en busca de pesticidas residuales y contenido fenólico en un solo ciclo o cuando se realizan análisis replicados de forma simultánea.
Cromatografía de líquidos en tándem

Cromatografía de líquidos en tándem

En las técnicas de cromatografía de líquidos en tándem se utiliza una segunda bomba y una conmutación inteligente de columnas para maximizar la utilización del detector, ya que se minimiza el tiempo de inactividad asociado con el reacondicionamiento de columnas. El gradiente en tándem se procesa en dos partes principales: La bomba número uno empuja el gradiente analítico por la columna número uno, mientras que la bomba número dos reacondiciona. A continuación, la bomba número uno empuja el gradiente analítico por la columna número dos, mientras que la bomba número dos reacondiciona la columna número uno.

  • Los métodos de LC en tándem son ideales en aplicaciones como la selección de plomo para laboratorios de descubrimiento de fármacos, ya que mejora el procesamiento de las muestras y maximiza la utilización del detector.
Cromatografía de líquidos de gradiente inverso

Cromatografía de líquidos de gradiente inverso

Un cambio en la composición orgánica en una elución de gradiente puede afectar a la respuesta del analito con algunos detectores (como los detectores de aerosoles cargados) y dificultar el análisis. La aplicación poscolumna de compensación de gradiente inversa elimina este efecto al garantizar que el eluyente que entra en el detector tiene exactamente la misma composición de disolvente durante toda la separación del gradiente.

  • Las separaciones de gradientes inversas se utilizan exclusivamente cuando se usa un detector de aerosol cargado en el ámbito farmacéutico, donde es esencial cuantificar las impurezas de los fármacos.

 
 
 
Preguntas frecuentes

¿Cuál es el principio básico de la HPLC?

El principio de separación de la HPLC se basa en la distribución de los compuestos de la muestra entre una fase móvil (desde la bomba) y una fase estacionaria (hacia una columna). Al pasar por la columna, los grupos de compuestos interactúan de forma diferente con la fase estacionaria y se conservan en función de sus propiedades químicas, lo que produce la separación.

¿Cómo funciona la HPLC?

Una bomba empuja la fase móvil a través de una columna empaquetada con una fase estacionaria. Un muestreador automático inyecta la muestra en la columna. La fase estacionaria separa los compuestos o analitos de la muestra. Un detector mide los analitos después de la separación y la elución de la columna.

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