Visão geral do ELISA

ELISA (Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) é uma técnica de ensaio baseada em placa, elaborada para detectar e quantificar substâncias solúveis como peptídeos, proteínas, anticorpos e hormônios. Outros nomes, como imunoensaio enzimático (EIA), também são usados para descrever a mesma tecnologia. Em um ELISA, o antígeno (macromolécula alvo) é imobilizado em uma superfície sólida (microplaca) e, em seguida, complexado com um anticorpo que está ligado a uma enzima repórter. A detecção é realizada através da medição da atividade da enzima repórter por meio da incubação com o substrato adequado para produzir um produto mensurável. O elemento mais crucial de um ELISA é uma interação altamente específica entre anticorpo e antígeno.

O artigo abaixo o guiará pelas decisões e opções para criar um ELISA. Você também pode visitar nosso Guia de seleção do construtor de ELISA, responder a uma série de perguntas e receber recomendações sobre quais componentes funcionarão melhor para suas necessidades de ELISA exclusivas.

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O ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) é um método poderoso para detectar e quantificar uma proteína específica em uma mistura complexa. Originalmente descrito por Engvall e Perlmann (1971), o método permite a análise de amostras de proteínas imobilizadas em poços de microplacas usando anticorpos específicos. Os ELISAs são normalmente realizados em placas de poliestireno de 96 ou 384 poços, que ligam passivamente anticorpos e proteínas. Essa ligação e imobilização de reagentes é o que torna os ELISAs fáceis de conceber e executar. Ter os reagentes do ELISA imobilizados na superfície da microplaca facilita a separação, durante o ensaio, do material ligado e do material não ligado. Essa capacidade de usar anticorpos de alta afinidade e lavar materiais vinculados não específicos torna o ELISA uma ferramenta poderosa para medir analitos específicos em uma preparação bruta.

Embora muitas variantes do ELISA tenham sido desenvolvidas e usadas em diferentes situações, todas dependem dos mesmos elementos básicos:

1. Revestimento/captura – imobilização direta ou indireta de antígenos na superfície dos poços de microplacas de poliestireno.
2. Bloqueio de placa – adição de proteínas irrelevantes ou outras moléculas para cobrir todos os locais de ligação de superfície não saturados dos poços da microplaca.
3. Sondagem/detecção – incubação com anticorpos específicos do antígeno que se ligam aos antígenos por afinidade.
4. Medição do sinal – detecção do sinal gerado pela enzima ligada (direta ou indiretamente) no anticorpo específico.

As enzimas ligadas geralmente são as horseradish peroxidase (HRP) (peroxidase de rábano) e a fosfatase alcalina (AP). Outras enzimas também têm sido utilizadas, incluindo β-galactosidase, acetilcolinesterase e catalase. Uma grande seleção de substratos está disponível comercialmente para a realização de ELISA com um conjugado HRP ou AP. A escolha do substrato depende da sensibilidade necessária do ensaio e da instrumentação disponível para detecção de sinal (espectrofotômetro, fluorômetro ou luminômetro).

Há vários formatos usados para ELISAs. Eles se enquadram nos métodos de captura e detecção direta, indireta ou sanduíche. A etapa principal é a imobilização do antígeno de interesse, seja através da adsorção direta na placa de ensaio ou seja por meio de um anticorpo de captura previamente adsorvido na placa. O antígeno é então detectado direta (anticorpo primário marcado) ou indiretamente (tal como anticorpo secundário marcado). O formato de ensaio ELISA mais utilizado é o ensaio ELISA tipo sanduíche, que indiretamente imobiliza e detecta a presença do antígeno-alvo. Esse tipo de ensaio de captura é chamado de ensaio "sanduíche" porque o analito a ser medido está ligado entre dois anticorpos primários, cada um detectando um epítopo diferente do antígeno – o anticorpo de captura e o anticorpo de detecção. O ELISA tipos sanduíche é altamente usado devido a sua sensibilidade e especificidade.

Entre os formatos de ensaio padrão discutidos e ilustrados acima, em que as diferenças na captura e na detecção forem a preocupação, é importante diferenciar entre as estratégias específicas que existem para a etapa de detecção. Independentemente do método pelo qual um antígeno é capturado na placa (por adsorção direta à superfície ou por meio de um anticorpo de "captura" pré-revestido, como em um ELISA tipo sanduíche), é a etapa de detecção (como detecção direta ou indireta) que determina em grande parte a sensibilidade de um ELISA.

O método de detecção direta usa um anticorpo primário marcado com uma enzima repórter ou uma tag que reage diretamente com o antígeno. A detecção direta pode ser realizada com um antígeno diretamente imobilizado na placa de ensaio ou com o formato de ensaio de captura. A detecção direta, embora não seja amplamente utilizada em ELISA, é bastante comum para a coloração imuno-histoquímica de tecidos e células.

O método de detecção indireta utiliza um anticorpo secundário marcado ou um complexo de biotina-estreptavidina para amplificação, sendo o formato mais popular para ELISA. O anticorpo secundário é específico para o anticorpo primário. Em um ensaio ELISA tipo sanduíche, é fundamental que o anticorpo secundário seja específico para a detecção somente do anticorpo primário (e não do anticorpo de captura) para garantir que o ensaio seja especifico para o antígeno. Para obter isso, geralmente são usados anticorpos primários e de captura de diferentes espécies hospedeiras (por exemplo, IgG de camundongo e IgG de coelho, respectivamente). Para ensaios tipo sanduíche, é benéfico usar anticorpos que tiverem sido adsorvidos cruzadamente para remover quaisquer anticorpos secundários que possam ter afinidade com o anticorpo de captura.

Comparação dos tipos de métodos de detecção de ELISA direto, indireto e sanduíche

Além dos formatos padrão direto e sanduíche descritos acima, existem vários outros tipos de ELISA:

O ELISA competitivo é uma estratégia comumente usada quando o antígeno é pequeno e tem apenas um ponto de ligação de epítopo ou anticorpo. Uma variação deste método consiste em marcar o antígeno purificado em vez do anticorpo. O antígeno não marcado das amostras e o antígeno marcado competem pela ligação ao anticorpo de captura. Uma diminuição no sinal do antígeno purificado indica a presença do antígeno nas amostras, quando comparado aos poços de ensaio com o antígeno marcado isoladamente.

O ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay, ensaio de imunospot ligado a enzima) refere-se à captura e à medição de proteínas secretadas por células que estao em poços de microplacas revestidos com membrana de PVDF. É um ensaio do tipo "sanduíche" no qual as proteínas são capturadas no local, pois são secretadas pelas células semeadas, e a detecção ocorre com um substrato precipitante. O ELISPOT é similar ao Western Blot, pois o resultado são manchas em uma superfície de membrana.

O ELISA em células é realizado com células que são colocadas na placa e cultivadas durante a noite em microplacas padrão. Depois que as células cultivadas são afixadas, permeabilizadas e bloqueadas, as proteínas-alvo são detectadas com anticorpos. Este é um ensaio indireto, não um ensaio do tipo sanduíche. Os anticorpos secundários são fluorescentes (para medição direta por um leitor de placa fluorescente ou microscópio) ou conjugados por enzimas (para detecção com um substrato solúvel usando um leitor de placa).

O ELISA é quase sempre realizado usando placas de poliestireno de 96 ou 384 poços e amostras em solução (por exemplo, fluidos biológicos, meios de cultura ou lisados de células). Essa é a plataforma discutida no restante deste artigo.

Ao desenvolver um novo ELISA para um antígeno específico, a primeira etapa é otimizar as condições de revestimento da placa para o antígeno ou o anticorpo de captura. Comece escolhendo uma microplaca de ensaio (não placas tratadas para cultura de tecidos) com uma capacidade mínima de ligação proteica de 400 ng/cm². Também é importante que o valor do CV (coeficiente de variação) da ligação proteica seja baixo (<5% é preferível) para que haja um desvio limitado em valores que devem ser idênticos nos resultados do ensaio entre poços e placas. A escolha da cor da placa depende do sinal que está sendo detectado. As placas de fundo plano de poliestireno transparente são usadas para detecção de sinais colorimétricos, enquanto as placas opacas pretas ou brancas são usadas para sinais fluorescentes e quimioluminescentes. Inspecione visualmente as placas antes de usá-las, quanto a imperfeições ou arranhões no plástico, pois isso causará aberrações ao adquirir dados do ensaio desenvolvido. As placas Thermo Scientific para ELISA estão disponíveis com várias superfícies para otimizar o revestimento com a macromolécula de sua escolha. Essas placas são projetadas para oferecer resultados ideais, confiabilidade de lote a lote e reprodutibilidade poço-a-poço.

O revestimento da placa é obtido por meio da adsorção passiva da proteína ao plástico da microplaca do ensaio. Esse processo ocorre por meio de interações hidrofóbicas entre os resíduos apolares das proteínas e o plástico da placa. Embora algumas proteínas possam exigir condições específicas ou pré-tratamento para aderir melhor, o método mais comum para revestir as placas a adição de uma solução de 2-10ug/ml de proteína dissolvida num tampão alcalino, tal como tampão fosfato (pH 7.4) ou tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,4). A placa é deixada para em incubação por várias horas durante a noite a 4–37º C. Normalmente, após a remoção da solução de revestimento, é adicionado um tampão de bloqueio para garantir que todas as superfícies de ligação restantes do poço de plástico disponíveis sejam cobertas (ver discussão posterior). As placas revestidas podem ser usadas imediatamente ou serem secas e armazenadas a 4º C para uso posterior, dependendo da estabilidade da proteína revestida.

É importante observar que as condições ideais de revestimento e a capacidade de ligação da placa podem variar de acordo com cada proteína/anticorpo e devem ser determinadas experimentalmente. Com exceção dos ELISAs do tipo competitivo, as placas são revestidas com mais proteína de captura do que a quantidade que pode ser realmente ligada durante o ensaio, a fim de possibilitar a maior faixa de trabalho de detecção possível. Algumas proteínas, especialmente anticorpos, são melhor revestidas em placas a uma concentração inferior à capacidade de ligação máxima, a fim de evitar a ligação inespecífica em etapas posteriores por um fenômeno chamado efeito "gancho". O efeito gancho provoca que as proteínas fiquem presas entre as proteinas de revestimento, o que impede a lavagem e a remoção de proteínas não ligadas. O efeito gancho provoca detecções inespecíficas do anticorpo primario e secundario , resultados com alto sinal de fundo e assim diminuindo a relação sinal/ruido e a sensibilidade de um ensaio.

Para a maioria dos anticorpos e proteínas, o revestimento de placas por adsorção passiva normalmente funciona bem. No entanto, podem surgir problemas de adsorção passiva, incluindo orientação inadequada, desnaturação, eficiência de imobilização insatisfatória e ligação de contaminantes juntamente com a molécula-alvo. Vários tipos de placas pré-revestidas podem ajudar a mitigar esses problemas. As placas pré-revestidas com com proteína A, G ou A/G podem ajudar a orientar os anticorpos de captura adequadamente e preservar a respectiva capacidade de ligação de antígeno. As proteínas de fusão podem ser fixadas a uma microplaca na orientação adequada usando placas revestidas com glutationa, metais-quelados ou anticorpos de captura. Peptídeos e outras moléculas pequenas, que normalmente não se ligam efetivamente por adsorção passiva, podem ser biotinilados e ligados com alta eficiência a uma placa revestida com as proteínas estreptavidina ou NeutrAvidin. Os anticorpos biotinilados também podem ser imobilizados em placas pré-revestidas com proteínas de ligação de biotina. A utilização de placas pré-revestidas dessa forma, separa fisicamente o antígeno ou anticorpo de captura da superfície da placa como proteção contra os respectivos efeitos desnaturantes. Superfícies revestidas e modificadas com polímero podem ser usadas para ajudar a aumentar a adsorção passiva. Há uma ampla seleção de placas revestidas de superfície de alto desempenho (pré-revestidas e pré-bloqueadas) em formatos de 96 e 384 poços (preto, claro ou branco). Essas microplacas revestidas podem ser usadas para desenvolvimento de ELISA e outros ensaios baseados em placa com leitores de placa colorimétrica, de fluorescência ou de quimioluminescência.

Diferentes tipos de microplacas para ELISA

O exemplo a seguir ilustra como as variações nos revestimentos de polímeros podem afetar as capacidades de ligação de proteínas.

Os anticorpos monoclonais ou policlonais podem ser usados como anticorpos de captura e detecção em ELISA tipo sanduíche e em outros sistemas ELISA. Os anticorpos monoclonais têm monoespecificidade inerente em relação a um único epítopo, que permite a detecção e quantificação finas de pequenas diferenças no antígeno. Os anticorpos policlonais são frequentemente utilizados como anticorpos de captura para retirar o máximo possível do antígeno. Em seguida, um monoclonal é usado como o anticorpo de detecção no ensaio do tipo sanduíche para fornecer uma especificidade melhorada. Além do uso de anticorpos monoclonais tradicionais, anticorpos monoclonais recombinantes também podem ser utilizados para ELISA. Anticorpos recombinantes são derivados de linhas celulares produtoras de anticorpos, desenvolvidas para expressar sequências de DNA de cadeia leve e pesada de anticorpos específicos. Em comparação com os anticorpos monoclonais tradicionais, derivados de hibridomas, os anticorpos recombinantes não são suscetíveis ao desvio da linhagem celular ou à variação de lote a lote, permitindo, assim, a especificidade máxima do antígeno.

Uma consideração importante no projeto de um ELISA tipo sanduíche é que os anticorpos de captura e detecção devem reconhecer dois epítopos diferentes não sobrepostos. Quando o antígeno se liga ao anticorpo de captura, o epítopo reconhecido pelo anticorpo de detecção não pode ficar mascarado nem alterado. Os anticorpos de captura e detecção que não interferem uns com os outros e podem se ligar simultaneamente são chamados "pares combinados" e são adequados para desenvolver um ELISA tipo sanduíche. Muitos fornecedores de anticorpos primários fornecem informações sobre epítopos e indicam pares de anticorpos que foram validados no ELISA como pares combinados. O uso do mesmo anticorpo para captura e detecção pode limitar a faixa dinâmica e a sensibilidade do ELISA final.

A capacidade de ligação dos poços de microplacas é normalmente mais elevada do que a quantidade de proteínas revestidas em cada poço. A área de superfície restante deve ser bloqueada para evitar que anticorpos ou outras proteínas sejam adsorvidos à placa durante as etapas subsequentes. Um tampão de bloqueio é uma solução de proteína irrelevante, mistura de proteínas ou outro composto que absorve passivamente em todas as superfícies de ligação restantes da placa. O tampão de bloqueio é considerado eficaz se melhorar a sensibilidade de um ensaio, reduzindo o sinal de fundo e melhorando a relação sinal-ruído. O tampão de bloqueio ideal liga-se a todos os locais potenciais de interação não específica, eliminando completamente o fundo, sem alterar ou obscurecer o epítopo para ligação de anticorpos.

Ao desenvolver qualquer novo ELISA, é importante testar vários bloqueadores diferentes para a relação sinal/ruído mais alta no ensaio. Muitos fatores podem influenciar a ligação não específica, incluindo várias interações proteína-proteína exclusivas das amostras e anticorpos envolvidos. O parâmetro mais importante ao selecionar um bloqueador é a relação sinal-ruído, que é medida como o sinal obtido com uma amostra contendo o analito alvo em comparação com o obtido com uma amostra sem o analito alvo. O uso de quantidades inadequadas de bloqueadores resultará em excesso de sinal de fundo e redução da relação sinal-ruído. O uso de concentrações excessivas de bloqueadores pode mascarar interações anticorpo-antígeno ou inibir a enzima, causando novamente uma redução da relação sinal-ruído. Nenhum agente de bloqueio é ideal para todas as ocasiões, e testes empíricos são essenciais para a verdadeira otimização da etapa de bloqueio.

Além do bloqueio, é essencial realizar lavagens completas entre cada etapa do ELISA. Etapas de lavagem são necessárias para remover reagentes não ligados e diminuir o fundo e, assim, aumentar a relação sinal/ruído. A lavagem insuficiente causará um sinal de fundo alto, enquanto a lavagem excessiva pode resultar em diminuição da sensibilidade causada pela eluição do anticorpo e/ou antígeno do poço. A lavagem é realizada em um tampão fisiológico, como solução salina com tampão de Tris (TBS) ou solução salina com tampão de fosfato (PBS), sem nenhum aditivo. Um detergente, como Tween-20 a 0.05%, normalmente é adicionado ao tampão para ajudar a remover material ligado inespecificamente. Outra técnica comum é usar uma solução diluída do tampão de bloqueio juntamente com um pouco de detergente adicionado. A inclusão do agente de bloqueio e a adição de um detergente em tampões de lavagem ajudam a minimizar o fundo do ensaio. Para obter melhores resultados, use detergentes de alta pureza para evitar a introdução de impurezas que possam interferir no ensaio, tais como inibidores enzimáticos ou peróxidos.

O estágio final em todos os sistemas ELISA é uma etapa de detecção. A menos que uma etiqueta radioativa ou fluorescente tenha sido usada, isso envolve a introdução de um substrato enzimático. A enzima converte o substrato em um produto detectável. Se um ELISA tiver sido construído e desenvolvido adequadamente, a intensidade do sinal produzido quando o substrato é adicionado será diretamente proporcional à quantidade de antígeno capturado na placa e ligado aos reagentes de detecção. Os anticorpos conjugados com enzimas (especialmente aqueles que envolvem peroxidase de rábano (HRP)) oferecem a maior flexibilidade em métodos de detecção e documentação para ELISA devido à variedade de substratos disponíveis para aquisição de imagens cromogênicas, quimiofluoresescentes e quimioluminescentes.

Substratos colorimétricos formam um produto solúvel e colorido que se acumula ao longo do tempo em relação à quantidade de enzima presente em cada poço. Quando a intensidade de cor desejada é atingida, a absorção do produto é medida diretamente ou, em alguns casos, uma solução de interrupção é adicionada para fornecer um ponto final fixo para o ensaio. Substratos colorimétricos estão disponíveis para peroxidase de rábano (TMB, OPD, ABTS) e fosfatase alcalina (PNPP). Embora não sejam tão sensíveis quanto substratos fluorescentes ou quimioluminescentes, substratos ELISA cromogênicos permitem fazer a visualização direta e a realização de estudos cinéticos. Além disso, substratos de ELISA cromogênicos são detectados com leitores de placa de absorção padrão, comuns a muitos laboratórios.

A quimioluminescência é uma reação química que gera energia liberada na forma de luz. A maioria dos substratos quimioluminescentes é dependente de HRP, embora estejam disponíveis alguns equivalentes de AP. A abordagem mais comum é utilizar luminol na presença de HRP e um tampão de peróxido. O luminol é oxidado e forma um produto de estado excitado que emite luz quando se decompõe para o estado básico. A emissão de luz ocorre somente durante a reação enzima-substrato, portanto, quando o substrato se esgota, o sinal é interrompido. A detecção quimioluminescente geralmente é considerada mais sensível do que a detecção colorimétrica. Uma desvantagem do uso de substratos quimioluminescentes para ELISA é que a intensidade do sinal pode variar mais do que com outros substratos. Para ensaios que exijam a leitura de muitas placas, isso pode ser um problema se o sinal começar a decair antes que as placas sejam lidas. Por esse motivo, é importante garantir que o ensaio tenha sido otimizado com o substrato para evitar a interpretação incorreta do desbotamento do sinal em uma amostra, como baixa abundância de antígenos. Substratos quimioluminescentes para HRP incluem substratos Thermo Scientific SuperSignal ELISA Pico e ELISA Femto.

Substratos de ELISA fluorescentes não são tão comuns e exigem um fluorômetro que produza o feixe de excitação correto para gerar emissão de sinal a partir da etiqueta fluorescente. A detecção quimiofluorescente também é baseada em enzimas, mas o produto gerado é fluorescente em vez de colorimétrico. O sinal é medido usando um fluorômetro com os filtros de emissão e excitação apropriados. As reações de quimiofluorescência são medidas ao longo do tempo em ensaios cinéticos ou interrompidas usando uma solução de interrupção para medição direta. Os substratos Thermo Scientific QuantaRed e QuantaBlu são exemplos de substratos quimiofluorescentes para HRP.

Além dos componentes individuais e dos princípios gerais do ELISA, discutidos neste artigo, os kits de ELISA prontos para uso estão disponíveis comercialmente para a detecção de centenas de citocinas específicas, quimiocinas, fatores de crescimento, analitos neurobiológicos e proteínas fosforiladas que são alvos comuns de interesse em pesquisa.

Para muitos alvos, dois tipos de kit estão disponíveis:

• Kits de ELISA revestidos: contêm placas de anticorpos pré-revestidas, anticorpos de detecção, tampões, diluentes, padrões, e substratos. Além dos kits de ELISA tradicionais, também estão disponíveis placas de kit de ELISA instantâneo que contêm todos os componentes necessários, incluindo anticorpos de captura e anticorpos de detecção liofilizada, estreptavidina-HRP e diluente de amostra. Além disso, poços de tira contendo o padrão para a curva padrão são fornecidos separadamente para permitir o uso completo dos 96 poços para amostras de ensaio.

• Kits de ELISA não revestidos: esses kits vêm com todos os reagentes necessários para revestir a própria placa e executar o ensaio, com exceção da solução de interrupção e do tampão de lavagem.
• Kits de pares de anticorpos: esses kits contêm anticorpos combinados otimizados para desenvolvimento e padrões de ELISA tipo sanduíche (sem placas ou reagentes de detecção).

Este guia de seleção de formato ELISA compara caraterísticas dos kits de pares de anticorpos Invitrogen com kits de ELISA.

1. John R. Crowther, Methods in Molecular Biology, The Elisa Guidebook. Second Edition. Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009.
2. Butler J.E. The Behavior of Antigens and Antibodies Immobilized on a Solid Phase (O comportamento de antígenos e anticorpos imobilizados em uma fase sólida). In: M.H.V. Van Regenmortel, ed. Structure of Antigens. Boca Raton, FL: CRC Press, 1992: 209-259. Vol.1, 209; CRC Press, Inc.
3. Lequin, Rudolf M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical chemistry 51.12 (2005): 2415-2418.
4. Engvall, Eva, and Peter Perlmann. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8.9 (1971): 871-874.
   
   

• Guia do ensaio de quantificação de biomarcadores: Ferramentas disponíveis para quantificação de biomarcadores de proteína e RNA
• Guia técnico e protocolos de ELISA
• Manuseio adequado de amostras para imunoensaios