CloneJET PCR 克隆试剂盒是一款多功能的阳性克隆筛选系统，可高效克隆任何 PCR 产物

灵活。创新。快速。

Thermo Scientific CloneJET PCR 克隆试剂盒是一款多功能的阳性克隆筛选系统，可高效克隆任何 PCR 产物。只需五分钟即可连接至阳性筛选载体，并获得超过99%的重组克隆。实验室常用的 E.coli菌株都可用该连接产物直接进行转化。

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为什么使用 CloneJET PCR 克隆试剂盒？

  • 快捷——可在短短5分钟内克隆 PCR 产物
  • 多功能性——适用于磷酸化或非磷酸化 的DNA 片段，以及平末端和粘性末端 PCR 产物
  • 高效——可获得超过99%的阳性重组克隆，且无克隆背景
  • 经济——无需昂贵的蓝白斑筛选
  • 兼容性强——可直接转化进常用 E. coli 菌株，包括 TOP10 和 XL1-Blue

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阳性克隆筛选原理

pJET1.2/blunt 载体携带一个致死性限制性酶基因，此基因在 DNA 片段插入克隆位点后即被破坏。因此，只有含重组质粒的细菌细胞才能生长形成菌落。如果 pJET1.2/blunt 载体在没有片段插入的情况下重新环化，会表达致死性限制性酶，其在转化后杀死宿主 E. coli 细胞。这种阳性筛选大大加快了菌落筛选的进程，节省了蓝白斑筛选所需的额外成本。 

为了便于对插入片段进行鉴定和后续处理，pJET 1.2/blunt 载体的多克隆位点包含两个 BgIII 识别序列，横跨插入位点两端。此外，载体含有用于 in vitro  和 in vivo转录以及插入片段测序的 T7 启动子。 

高效

通过校正 DNA 聚合酶（例如 Phusion DNA 聚合酶）获得的平末端 PCR 产物可在5分钟内直接连接到载体中。使用 CloneJet PCR 克隆试剂盒包含的专有热稳定 DNA 平端化酶，可在连接前5分钟内将具有 3'-A 突出端的 PCR 产物进行平端化处理。CloneJET 克隆试剂盒的平末端和粘性末端片段的克隆效率，和基于连接酶的克隆试剂盒（供应商 A）相当，如图1所示。但在使用基于拓扑异构酶的克隆试剂盒（供应商 B）克隆平末端 DNA 片段时，克隆效率大幅下降。   

图1.粘性末端和平末端 PCR 产物克隆效率。根据供货商推荐的方案，将由 Taq DNA 聚合酶或 Phusion DNA 聚合酶生成的976 bp PCR 产物连接到不同的克隆载体中。使用供货商指定片段作为阳性对照。各取2 μl 连接混合物转化 E. coli DH10B 细胞。供货商提供的感受态细胞用于相应基于拓扑异构酶的反应。根据对照物的阳性重组百分比，计算克隆效率。 

尽管 CloneJET PCR 克隆系统的克隆效率与基于连接酶的 PCR 克隆试剂盒相当，但使用 CloneJET 试剂盒产生的重组克隆的转化效率要比后者高2到10倍（图2）。

图2.粘性末端和平末端 PCR 产物转化效率。根据供货商推荐的方案，将由 Taq DNA 聚合酶或 Phusion DNA 聚合酶生成的976 bp PCR 产物连接到不同的克隆载体中。使用供货商指定片段作为对照。各取2 µl 连接混合物转化 E.coli DH10B 细胞。感受态细胞的转化效率是1.2×10E7转化子/μg 超螺旋 DNA 。 
应用
  • 克隆长达10 kb 的平末端或3'-dA 加尾 PCR 产物
  • 克隆由限制性内切酶酶切后的 DNA 片段
  • 克隆DNA的测序
  • 由T7启动子引导的克隆插入片段 in vitro 和 in vivo 转录
试剂盒组分

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仅供科研使用，不可用于诊断目的。