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LanthaScreenEu激酶结合实验技术概述
实验概述
使用此种实验形式，您可以：
- 确保你在使用这种本质验证的系统测量正确的激酶
- 实现激酶抑制因子（包括变构体）的灵敏检测
- 检测活性和非活性激酶
- 实时追踪慢速结合抑制因子
- 比较抑制因子开关率
使用LanthaScreen Eu激酶结合检验，已有超过200种GST和His标签经过检测和验证。
查看使用这种检验形式可检验与验证什么类型的激酶，查看详细实验方案，同时学习如何购买您开始实验所需的试验组分
图1 为LanthaScreen Eu激酶结合实验的原理。 通过添加Eu标记抗体或者抗标签抗体检测 Alexa Fluor偶联物或激酶“示踪剂”结合。 示踪剂和抗体与激酶的结合导致高度的FRET，反之使用激酶抑制因子代替示踪剂会造成FRET丢失。 与其它许多激酶活性实验不同，此实验是简单的“混合与读取”检测，不需要展开步骤。
图 1. LanthaScreen激酶结合实验图示 任何来自LanthaScreen Eu激酶结合实验结果的信号都是由Eu-anti-epitope标签抗体与激酶特异性结合产生的。 这可确保信号不是由于检测样本中存在的其它激酶/酶而产生的，因为其它激酶或磷酸酶没有标签或者带有其它标签，因此没有信号。 实际上，额外的激酶或磷酸酶（带有替代标签或没有标签）可以添加到结合反应过程中，改变目标的磷酸化状态，无需去除或灭活。
Invitrogen公司的激酶示踪剂是基于ATP竞争性的激酶抑制因子，适于检测任何结合到ATP位点或结合到能改变ATP构象的异构位点的化合物。 结合到ATP位点的抑制因子包括仅结合在ATP位点上的I型激酶抑制因子和既结合ATP位点也结合暴露在DFG-out（非活性构象）疏水位点的II型抑制因子（例如Gleevec/Imatinib、Sorafenib、BIRB-796）。 III型抑制因子是未完全结合ATP的化合物，被统称为变构抑制因子。
对15种III型抑制因子的研究表明，除了其中一种化合物外，所有的化合物在结合实验中都显示与活性检测相同的效价。 唯一的例外是竞争性化合物，因此它不是一种真正的异构抑制因子。
与活性实验不同，激酶结合实验在激酶处于活性状态或非活性状态下都能进行，很适于检测II型抑制因子，如图2所示。 在某些情况下，除了II型抑制因子，也能观察到I型和III型抑制因子选择性结合到特异性活性位点
图2. II型抑制因子Gleevec优先与unphosphorylated Abl结合。
A.Gleevec的亲和力通过结合实验测定，实验方法为将His-tagged Ab1（1 nM）（经过磷酸酶处理和未经过磷酸酶处理）与0.25 nM激酶示踪剂178及2 nM Eu-anti-His-Tag抗体混合后进行TR-FRET检测。 B.用星孢菌素代替Gleevec进行相同实验。
某些被称为“变构”抑制剂的一个额外性质是具有较慢的化合物结合速率，这是由于该化合物倾向于结合激酶的多种构象中的一种，而该构象与其它构象之间是平衡转化的关系。 虽然这一性质可以通过将激酶和抑制剂预孵育后在不同时间点对激酶活性进行监控来检测，但是直接监控这种结合将容易的多，如本例所证明的，可以在不同时间点直接监控BIRB-796和p38 alpha的结合，如图3所示。
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图3. BIRB796的慢速结合 A．观察到II型激酶抑制剂BIRB796的慢速结合 B． I型抑制剂SB202190表现出了非时间依赖性。
大多数适用于铕基TR-FRET检测系统的仪器、设置、滤镜也适用于LanthaScreen Eu激酶结合实验 和其它TR-FRET系统相同，铕供体由一个带30 nm光栅的340 nm激发滤镜激发 使用中心在 665 纳米处、带通为 10 纳米的滤光片，以检测转移至 Alexa Fluor 647 示踪剂的能量。 然后这一信号被替代为（或者说“提取为”）铕的峰值激发，这是使用一个615nm，10 nm光栅的滤镜完成的。 使用 665 纳米信号除以 615 纳米信号来计算“发射比”。
为协助您确定您的仪器是否适用于读取LanthaScreen Eu激酶结合实验，或者为获得仪器设定的协助，请您拨打1-760-603-7200 (选择3，然后输入分机号40266).
*仅供研究使用。 不得用于任何动物或人类的治疗或诊断。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。
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