Search Thermo Fisher Scientific
用于液体活检临床研究的 Oncomine 游离核酸检测
从血液样本到突变数据的游离核酸综合液体活检工作流程
Ion Torrent Oncomine 游离核酸检测是一种多生物标记物的新一代高通量测序 (NGS) 检测方法，可以检测血浆中的体细胞突变，实体肿瘤相关基因检测下限可低至 0.1%。当将其用作完整的液体活检 NGS 工作流程的一部分时，从血液样本到突变数据的获得只需要两天。
每一个检测试剂盒都含有文库构建所用的试剂以及一组用于进行多重 PCR 的引物库，以便利用从全血血浆组分中发现的游离 DNA (cfDNA) 和游离 RNA (cfRNA) 进行扩增子文库的制备，并且以上都是从游离核酸中检测肿瘤来源 DNA 和 RNA 的完整研究解决方案的一部分。
使用单管血液，我们的检测可用于分析在癌症样本中经常发生的突变，例如单核苷酸突变、短缺失和插入、拷贝数变异及融合。该检测法可实现低至 0.1% 的检测下限 (LOD)。
液体活检相比于传统实体肿瘤样本检测的优势：
- 获取样本的侵入性更低，可以多次采样获得肿瘤来源的核酸
- 与传统组织样本相比，成本更低
- 更快地从样本获取结果
- 有助于捕获更多肿瘤异质性信息
- 未来可能提升医护标准
我们现在都已知道，癌症是一种分子疾病。为了更好地推进今后的癌症研究，我们需要更清晰地理解癌基因和癌蛋白如何随着时空发生变化。液体活检应用使临床研究人员以前所未有的方式研究肿瘤。
在过去，有关 cfDNA 的癌症临床研究主要集中在数字 PCR 或微滴式数字 PCR 上的应用，主要分析低频突变样本。这些方法尽管灵敏，但靶标基因数量有限，因而限制了研究人员的视野。
Oncomine 游离核酸研究检测试剂盒与 Ion GeneStudio S5 高通量测序系统，使您可采用低至 1 ng 的起始 DNA，进行肿瘤异质性研究、疗法筛选研究、疗法监测研究、以及复发性研究。
检测类似 EGFR T790M 的突变
“使用 Oncomine Lung cfDNA 检测试剂盒，我们能够对复杂样本进行靶向扩增。该检测使我们可以检测类似低至 0.14% 等位基因频率的 EGFR T790M 突变。
José Luis Costa博士
高级研究员
葡萄牙波尔图大学分子病理学和免疫学研究所（Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto, Portugal）
针对液体活检临床研究进行了优化，主要关注于游离核酸的主要驱动因子和抗性突变
Oncomine 游离核酸研究检测试剂盒包括由癌症基因组学数据资源 Oncomine Knowledgebase Reporter 确定的靶标，并由临床研究人员进行了审核。
Oncomine 游离核酸研究检测试剂盒基因列表
检测试剂盒 | DNA/RNA | 基因 | 精选单核苷酸突变（SNV）热点 | CNV | 融合 | 其他 | |
DNA 和 RNA | AKT1 ALK APC AR ARAF BRAF CCND1 CCND2 CCND3 CDK4 CDK6 CHEK2 CTNNB1 DDR2 EGFR ERBB2 ERBB3 ERG ESR1 ETV1 FBXW7 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4 FLT3 | GNA11 GNAQ GNAS HRAS IDH1 IDH2 KIT KRAS MAP2K1 MAP2K2 MET MTOR MYC NRAS NTRK1 NTRK3 PDGFRA PIK3CA PTEN RAF1 RET ROS1 SF3B1 SMAD4 SMO TP53 | 超过 900 个热点，包括： BRAF
| CCND1 CCND2 CCND3 CDK4 CDK6 EGFR ERBB2 FGFR1 FGFR2 FGFR3 MET MYC | ALK BRAF ERG ETV1 FGFR1 FGFR2 FGFR3 MET NTRK1 NTRK3 RET ROS1 | MET exon 肿瘤 | |
Oncomine Lung cfTNA 检测试剂盒 | DNA 和 RNA | ALK BRAF EGFR ERBB2 KRAS MAP2K1 MET NRAS PIK3CA RET ROS1 TP53 | 超过 150 个热点，包括： EGFR: T790M，C797S， | MET | ALK, RET,ROS1 | MET exon 14 skipping | |
Oncomine Lung cfDNA 检测试剂盒 | DNA | ALK BRAF EGFR ERBB2 KRAS MAP2K1 MET NRAS PIK3CA ROS1 TP53 | 超过 150 个热点，包括： EGFR: T790M, C797S, L858R, Exon 19 del KRAS: G12X, G13X, Q61X | --- | --- | --- | |
Oncomine Breast cfDNA 检测 v2 | DNA | AKT1 CCND1 EGFR ERBB2 ERBB3 ESR1 FBXW7 FGFR1 KRAS PIK3CA SF3B1 TP53 | 超过 150 个热点，包括： ESR1：与抗雌激素抗性相关的突变 TP53：与功能丧失相关的突变 ERBB2: 与抗 ERBB2 疗法敏感度相关的突变 | CCND1, ERBB2, | --- | 扩大 TP53 覆盖度 | |
| Oncomine Breast cfDNA 检测试剂盒 | DNA | AKT1 EGFR ERBB2 ERBB3 ESR1 FBXW7 KRAS PIK3CA SF3B1 TP53 | 超过 150 个热点，包括：PIK3CA: E545K, H1047R AKT1: E17K ESR1：与抗雌激素抗性相关的突变 TP53：与功能丧失相关的突变 ERBB2: 与抗 ERBB2 疗法敏感度相关的突变 | --- | --- | --- | |
| Oncomine Colon cfDNA 检测试剂盒 | DNA | AKT1 APC BRAF CTNNB1 EGFR ERBB2 FBXW7 GNAS KRAS MAP2K1 NRAS PIK3CA SMAD4 TP53 | 超过240个热点包括： KRAS/NRAS: G12/G13/Q61 BRAF: V600E PIK3CA: E545K, H1047R TP53: R175H R273H/C/L 复发的有害 APC 突变（包括 p.R876*, p.R1114*, p.Q1378*, p.R1450*）SMAD4: R361C/H CTNNB1: S45F, T41A | --- | --- | --- | |
| 热点基因 | 肿瘤抑制基因 | 拷贝数基因 | 基因融合 | |
| AKT1 ALK AR ARAF BRAF CHEK2 CTNNB1 DDR2 EGFR ERBB2 ERBB3 ESR1 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4 FLT3 GNA11 GNAQ GNAS | HRAS | APC | CCND1 | ALK |
- 单管血样—从单管血样实现从样本到数据的两日工作流程
- 高价值的检测内容—包含 OncoNetwork 联盟和行业专家精选并验证的关键靶标，可分析各种类型的关键突变（SNV、插入缺失、CNV、融合）
- 样本起始量灵活—灵活的样本起始量，可容许样本起始量变化，以容纳更多的样本
- 低检出限—可检测频率低至 0.1% 的 SNV 热点和插入缺失
- 成本更低—对特定肿瘤类型的扩增子具有一致的覆盖度，每次测序运行可处理更多样本
- 优化的分析程序— variant caller 有助于提升灵敏度和特异性
由于样本间的游离核酸存在差异，因而灵活支持不同起始量的 DNA 变得尤为重要，尤其是在样本量较少时。Oncomine 游离核酸检测可支持不同的样本起始量（图1）。从尽可能多的样本获得数据结果，是推进液体活检研究的关键步骤。
Click to enlarge
图 1.扩增子覆盖度和起始样本，决定了使用 Oncomine cfDNA Assay 时的检测下限。
在验证研究中，该检测方法证明，福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE)样本检出的突变与血浆之中检出的突变存在高度关联性（表 1） 。正如我们所预料的，相比于血浆，FFPE 肿瘤样本的等位基因突变频率更高，FFPE 和血浆样本均观察到~50%预期水平的胚系突变。
样品 | 突变 | FFPE | 血浆 |
|---|---|---|---|
1 | EGFR-L858R | 71.42% | 2.62% |
2 | TP53-R158L | 51.89% | 4.32% |
3 | MET-T1010I | 43.87% | 51.57% |
4 | N/A | 未检出 | 未检出 |
5 | EGFR-L858R | 58.44％ | 7.28% |
6 | TP53-R158L | 10.19% | 1.26% |
表 1.FFPE 和配对的血浆样本结果的关联性（晚期肺癌样本）。采用 Oncomine 游离核酸检测检出的 FFPE 样本突变与配对的血浆样本简出的突变具有高度相关性。上述数据均采用 Oncomine Lung cfDNA Assay 获得。粗体数值表示体细胞突变。非粗体值表示胚系突变。
总体而言，Oncomine 游离核酸（cell-free）检测能够从更多样本中获得结果，通过使用临床研究样本，在整个 Oncomine 游离核酸检测组合中，都获得了检测限为0.1％、灵敏度为90％、特异性> 98％的可重复结果。
样品 | EGFR | EGFR | EGFR | EGFR | KRAS | NRAS | NRAS | PIK3CA |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
0.1% HDX | 0.06 | 0.17 | 0.06 | 0.10 | 0.22 | 0.17 | 0.15 | 0.10 |
1% HDX | 0.72 | 1.07 | 0.75 | 0.74 | 1.14 | 1.15 | 1.15 | 2.29 |
5% HDX | 4.52 | 4.86 | 6.32 | 3.97 | 6.34 | 6.11 | 6.94 | 5.29 |
100% WT | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表 2.Horizon cfDNA Multiplex Reference Set 检出的变异。所有8个突变热点的检出率均为0.1％。所获得的数据均使用 Oncomine Lung cfDNA 检测试剂盒获得。
在 Ion 530 芯片上运行 8 份样本，或在 Ion 540 芯片上运行 32 份样本， Oncomine 游离核酸检测均可对常见肿瘤类型之中经常突变的单核苷酸突变 (SNVs) 、短链插入缺失、拷贝数变异、以及融合进行有效地多重 PCR 分析，且可容许起始样本量变化，可容纳的起始样本量低至 1 ng。
从使用 Applied Biosystems MagMAX 游离核酸提取试剂盒进行游离核酸分离到样本分析的整个工作流程（图 2），可在 2 天内在 Ion GeneStudio S5 Prime 高通量测序系统上完成。
制备
- 游离核酸提取（MagMAX 游离核酸提取试剂盒）
- 文库制备（Oncomine 游离核酸检测）
- 模板制备（Ion Chef 系统）
测序。
- 高通量测序（Ion GeneStudio S5 系列高通量测序系统）
分析。
- 用于优化分析的突变检出程序（Torrent Suite/Ion Reporter 软件）
- 标签、指南和全球临床试验（Oncomine Knowledgebase Reporter 软件）
Oncomine 游离核酸检测是液体活检临床研究完整工作流程的一部分，该流程包括：
Oncomine 游离核酸检测
一个试剂盒，其包含文库构建试剂以及多重 PCR 引物库，其可利用在全血血浆组分中发现的游离核酸制备扩增子文库。
标记测序条码接头库 1–24 和 25–48
一套专用于确保我们的技术具有最佳性能的独特条码接头。这套独特的条码接头兼容 Ion S5、Ion PGM 和 Ion Proton 高通量测序系统。结合上述试剂盒使用时，该条码接头库可让您混合至多 24 个扩增子文库进行多重测序分析，从而帮助您降低每份样本的测序成本。
Ion GeneStudio S5 系列高通量测序系统
Ion GeneStudio S5 系列高通量测序系统支持五种不同的芯片类型，因此您可以在单台测序仪上进行多种应用。这种灵活性避免了一次测序对样本数量的限制，以实现最佳的成本效率。直接选择和您的特定通量或应用需求匹配的芯片类型即可。
资源
** Oncomine Knowledgebase Reporter 在 Ion Reporter™ v 5.2 以上版本软件中启用。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。