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流式细胞仪选购注意事项
研究人员如今正面向更广泛的研究领域开发创新应用，以用于新型研究领域、提高数据质量并扩展实验研究范围。 而这些进步的取得主要得益于日渐成熟、精湛的仪器设计和技术—特别是流式细胞术。 正是因为研究人员的需求，才推动了整个市场仪器的发展，从而产生了能够满足各种实验室需求和预算的先进流式细胞仪。
了解主要实验概念和流式细胞仪组件，包括：
- 比较不同流式细胞仪的硬件配置
- 荧光信号检测技术的重要性
- 最适合重要应用（如免疫分型、肿瘤和粘性细胞等难分离样本、稀有事件的大体积需求以及特殊研究目标）的流式细胞仪液流系统和光学系统设计技术
通过比较技术参数、评估液流系统和光学系统以及参加技术研讨会获得的客观信息，使首席研究员、流式平台管理者和实验室研究人员可以综合考虑不同品牌或型号的仪器，从而作出明智的购买决策。
流式细胞仪液流系统的硬件组成
流式细胞术是对液体中单个悬浮细胞或其他微粒进行多参数分析的一门实验技术。相较于成像和PCR等其他方法，因其细胞流或微粒流可收集样品中单个细胞的信息，所以具有明显优势。需注意，样品进入仪器并被输送至光学系统的过程需成熟、精湛技术的支持。
液流系统的重要性
流式细胞术的强大之处在于能够对异质细胞群中单个细胞的物理特性进行定量分析。这一过程需要液流系统将大量细胞输送至流式细胞仪器中，以产生具有统计学意义的数据。为获得准确的计数和测量，进入和流过仪器的细胞流必须保持稳定、一致。
高速上样时的重合事件
图 1. 重合率。 (A)一个细胞被激光束激发。 (B)两个细胞被激光束激发，产生双重信号。 双重或三重细胞信号会掩盖样品的真实生物特性。
细胞以混乱无序的方式进入流式细胞仪。理想状态下，它们排成单列通过激光检测点，从而实现单个细胞检测。但在某些情况下，细胞会一起流过激光检测点（基于泊松分布或者样品含有细胞团块）。 而当一个以上细胞同时出现在激光检测点时，则称为重合事件 。
两个细胞同时通过激光束，会导致难以区分目标细胞。如果其中一个细胞是阳性，另一个细胞是阴性，仪器会将该事件视为阳性信号。这种情况下，从该事件获得的数据即为重合事件，且数据不可信。液流聚焦技术为在光学系统中实现单个细胞检测提供了可能性。
液体输送系统
图 2. 将细胞输送进流式细胞仪的系统。( A )基于压力的液流系统利用样品流与样品流周围鞘液流的压力差进行运行。 ( B )基于体积的液流系统可测定准确的样品体积，从而实现浓度和绝对计数检测。
基于压力和基于体积的液流系统是细胞进入流式细胞仪的两种常见机制。
含有大量细胞的样品可以通过气压泵液流系统快速进入仪器：首先，使用特殊样品管形成密封环境，产生增压系统。然后，密封的样品管会促使样品与仪器鞘液之间产生压力差，从而将细胞送入光学系统。该系统的优势在于：可平稳输送样品、输送大体积样品并降低样品溢漏风险。缺点是存在反压问题，如果维护不当，容易发生管路堵塞。
基于体积的液流系统可实现更灵活的细胞输送，它采用了测量样品精确体积并将其注入仪器的机制。该系统的优势包括可进行绝对细胞计数和处理难分离样品，包括粘性细胞或大细胞，这是因为它不易发生管路堵塞。此外，该系统可使用任何类型的样品管或微孔板进行上样，因此具有更高使用价值。
样品输送系统
图 3. 两种类型的泵。 (A)蠕动泵利用旋转头系统输送液体。 旋转头中的转子向管道施压，驱使液体向前流动。 (B注射泵抽取样品并将其注射到流体系统中。
基于压力和体积的系统利用蠕动泵或注射泵完成样品输送。
对于不太昂贵的仪器来说，蠕动泵是一种常见的低成本选择。配有这类泵的液流系统利用一系列转动轴挤压管道而输送液体。它可快速输送大体积样品。但是，该技术无法提供准确的细胞计数，因为输送到仪器中的样品量随泵的旋转而上下波动。
基于体积的输送系统采用注射泵，从而可以精确控制和测量样品体积。 注射泵能实现绝对细胞计数和样品回收。其回收的样品可用于其他实验，如PCR和成像实验，或可再次储存以便用于下次实验。体积样品输送是一种高品质、精心设计的输送系统，可将细胞精确输送至仪器中。
使悬浮细胞流入光学系统的技术
图 4. 细胞聚焦系统。
仪器可采用不同的流体学方法采集流过光学系统的单个细胞。
大多数流式细胞仪采用传统流体学聚焦技术，如流体动力学聚焦。 该技术利用鞘液与细胞样品间的压力差和速度差，推动细胞向前流动。
部分流体学系统采用声波辅助流体动力学聚焦。该聚焦技术是对传统系统的进一步改良，利用声波将细胞聚焦于流动室的中央，再利用传统流体动力学技术将细胞输送到光学系统中。声波聚焦技术不仅可以减少液体使用量，还可保留流体动力学聚焦的优势。通过将声波聚焦和鞘液结合使用，可将细胞排成单列，从而实现更快的上样速度和更低的重合率。而鞘液的使用量少也有利于保持流动室清洁并降低管路堵塞风险。该技术上样速度快，特别适合于检测大体积稀释样品。
样品处理
压力液流系统使用流式管进样，大多情况下一次只能处理一个样品。 对于高通量应用，这些流式细胞仪可装配独立的多孔上样器。有些型号的仪器需要使用特殊样品制造压力差，才能使样品进入流式细胞仪，因此不适合使用多孔板采样。
基于体积的流式细胞仪使用样品管和多孔板均可以完成进样。移液管式注射器可将样品混匀并注射到仪器中。
多孔板采样器可与机械臂连接，用于高通量处理多个微孔板。这些系统具有更强大的液流系统，支持多孔板的持续运行，因此可处理大批量样品。
流式细胞仪的光学元件选择
流式细胞仪中的光学系统可直接影响实验的设计和运行。其中，激光器为激发与抗体或试剂偶联的荧光染料提供光源，以用于检测和分析各种细胞组分及特性。检测器用于捕获特定波长的光并将其放大和分离，从而提供待测荧光染料的详细特定物理特性信息。激光器和检测器技术决定了实验所用荧光染料的数量和类型。因此，为获得最佳数据，有必要了解多种光学系统元件。
光学系统的重要性
对单个细胞及其物理特性的鉴定情况取决于激光器的能量和检测系统的灵敏度。大部分实验需要使用多种荧光染料标记细胞表面和细胞内蛋白质，以便鉴定细胞群体、细胞周期、群体倍增数、凋亡和细胞活性等。良好的光学系统和高品质元件可全面捕获细胞的生物学和生物化学特性。
光学系统的灵敏度和光谱范围对于检测荧光染料的发射光非常重要
荧光染料的激发波长和发射波长
图 5. 荧光染料的激发波长和发射波长。 ( A )具有多种荧光标记的细胞。 ( B )PE和FITC均由蓝色 488 nm激光激发，具有重叠的发射光谱。 ( C ) 黄色 561 nm激光可激发PE，但不能激发FITC。 ( D ) Alexa Fluor 647染料由红色640 nm激光激发。
光谱重叠（荧光重叠）
图 6. 双重激发最大波长。 (A) PE可由488 nm激光激发。 (B) PE还可由最大激发波长为561nm的激光激发。 使用该激光激发PE，能使其更高效地发射荧光。
有些荧光染料具有多种激发波长，其激发效率也有所不同。例如，蓝色488和黄色561 nm激光都能激发荧光染料PE。蓝色488激光可在低能级激发PE。黄色561 nm激光可为荧光染料提供更多的激发能量，从而产生更多的发射光子。强发射光可分辨数量少的、表达低的细胞群体，而使用不配备黄色561nm激光的仪器可能无法观察到这些群体。
光学元件技术
激光器
图 7. 常用荧光蛋白和染料的激光波长。
市售流式细胞仪一般配有紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、绿色（532 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）等激光器 。基础配置通常包含蓝色488 nm激光器。增加激光器可为增加实验所用荧光染料数提供可行性。紫色、蓝色、黄绿和红色激光器足以用于激发多色实验所用的大部分荧光染料。此外，有些流式细胞仪还配有350 nm范围内的紫外激光器，以扩大多色实验的激发和发射波长选择范围。
激光分布图
图 8. 激光对准。 (A)细胞接收到正确对准激光器的的全部激光能量。这可确保每个细胞都具有相等的荧光染料激发能量，从而减少数据差异。( B )激光未对准可能导致荧光染料激发能量的分布不均；增大数据差异。
为比较实验中不同细胞间的发射荧光信号，应确保每个细胞接收到相等的激光激发能量。正确的激光对准将产生一致的激光束输出，有助于为通过激光检测点的每个细胞提供最佳信号。对准激光束产生的数据具有生物学差异，而非仪器差异。
在弱表达细胞样品中，次优级激发能量可能产生阴性结果。激光能量不一致，会导致从细胞中收集的发射信号产生较大差异，进而造成更大的统计错误。而激光对准偏移，可能会使流过激光束的每个细胞接收到较少或不均等的激发能量。
图 9. 激光分布图。 (A)高斯发射分布图。光子在中心位置密集分布且最强烈。( B )平顶光斑激光器覆盖了更大和更多平坦区域。细胞可通过更宽的峰顶而产生荧光。
大部分流式细胞仪采用高斯分布激光器。细胞必须通过光束中心，才能获得最佳激发能量。
最新开发的平顶光斑激光器覆盖了更大的荧光染料激发区域。其更宽的峰顶使样品中的细胞能够均匀利用能量，有助于产生一致的检测结果。
激光装置
图 10. 激光装置。 (A)共线激光装置利用多个激光器聚焦于同一个激光检测点。 ( B )空间分离的激光装置呈单个排列，依次聚焦于通过激光检测点的细胞。
仪器中的多个激光器排布通常采用两种排列方式 。激光装置会影响实验所用的荧光染料数量以及细胞荧光的检测。
共线装置的所有激光器同时发射激光，并聚焦于同一区域，从而同时激发多种不同荧光染料。
因多种荧光信号同时发射且需要更多补偿，这种激光装置的多色组合设计灵活性较低。共线激光装置适用于两种不同波长的激光器，用于激发几乎没有或没有重叠发射光谱的荧光染料。经济型流式细胞仪可能会采用这种激光装置，以节省光学元件成本。
空间分离装置依次激发细胞流；使用多种荧光染色的细胞依次通过各个激光束，每个检测器分别激发和检测发射光谱。使用这类装置的优势在于：可灵活选择实验所用的染料数量；此外，独立发射的荧光信号具有更高的灵敏度并且需要更少的补偿；该装置在相近发射光谱中产生的荧光重叠大大减少，因此可以更容易地创建多色实验方案。
荧光分离元件
图 11. 荧光发射光谱。 (A)荧光染料受激发后在有限的波长范围内发出荧光。 ( B )有些荧光染料之间具有重叠的发射光谱。
荧光染料受激发后在一定的光谱范围内发光，而不是在特定波长发光。发射荧光通常需要通过光学滤光片 ，才能被捕获和分析。若不经过荧光分离，未过滤的多种荧光会发生重叠，导致结果难以分析。
图 12. 荧光分离元件。 (A)光学滤光片根据荧光波长范围分离荧光染料的发射信号。 ( B )棱镜单色仪阵列将光线分到不同波长区域，并将这些区域的光聚焦到不同检测器上。
基于光学滤光片的不断开发，如今已可对使用多种荧光偶联抗体标记的细胞进行分析。这些荧光分离元件易于获取且可更换，最常用于流式细胞仪中的荧光分离。通过组合不同的滤光片，可设计各种颜色组合，从而创建小型或大型的多色方案。这是一个经过检验的可靠系统，并具有持久耐用的元件。我们希望此类系统的滤光片易于更换，以方便不同的染料组合使用。
光谱流式细胞术与传统流式细胞术有所不同；光谱流式细胞仪利用棱镜聚焦可见光谱内的发射荧光。来自多种荧光染料的发射光会发生重叠，所以需要复杂的算法进行进一步分离。而该技术的优势在于它为有限的激光器提供了更多颜色通道。该技术仍处于开发阶段，并且某些荧光染料的计算荧光分离技术较为有限。
发射检测器
图 13. 发射光检测元件。 (A)PTM捕获并放大荧光染料发射的信号。 ( B )APD捕获半导体上的光子并放大信号。
来自单个细胞的发射荧光信号较弱。为方便分析，需要将发射光转换为一种可调整的数据格式。为此， 发射检测设备捕获荧光并将光波转换为电子信号；并将独立的电子信号放大，获得可供用户处理的数据。
光电倍增管（PMT）是为大多数流式细胞仪所采用的检测设备；多个光电倍增管（PMT）排列在光路末端，可捕获每个经过滤的荧光信号。因其可以在从紫外到红外的广泛光谱范围内以线性方式捕获荧光的动态范围—非常微弱到非常明亮的信号范围，所以非常适用于多色组合实验。
其他检测设备还包括用于引导和放大发射荧光生成电子的雪崩光电二极管（APD）。对于主要检测远红外光谱内的荧光染料发射光的实验，它们可高效捕获在红外和近红外光谱区域内发射的信号。
电压设置
图 14. 电压设置。 (A)由于光电倍增管（ PMT）电压过高，使得荧光染料标记细胞的阳性发射信号不在可检测范围内并且超出刻度范围。 ( B )降低电压后，可检测到阳性信号。
在流式检测中，样品背景可能来自于细胞或样品其他成分的自发荧光。如要实现染色细胞物理特性的全面可视化，需要捕获阳性信号中的全部阴性（昏暗）信号。也就是说，需调整至理想的光电倍增管（ PMT）电压，使相关染色的荧光信号与细胞的可检测（阴性）自发荧光实现最佳分离。
在运行细胞样品前，应使用荧光标准品优化流式细胞仪的光电倍增管（PMT）电压，以计算每个光电倍增管（PMT）的最佳电压。
可根据需要调整光电倍增管（PMT）电压，特别是在阳性信号过亮的情况下。调整时，用户可使用未染色的对照细胞作为背景信号的阴性对照。而对光电倍增管（PMT）电压进行降低操作，可实现合适的阳性信号检测并降低阴性群体的强度值。
流式细胞仪检测到的荧光信号数量也会受电压设置的影响。设置更高或更低的电压，会在光电倍增管（ PMT）检测器上产生更多或更少的增益，从而实现合适的荧光信号检测。
固定电压设置是简单流式细胞仪功能的一部分，因此简单流式细胞仪的可检测发射荧光范围有限。调整电压设置可能比较困难，因为用户需要区分阳性细胞群体与背景信号。新用户可能会设置过高或过低的电压。为帮助这些用户，小型多色实验方案及其相关检测器的电压会被锁定。 具有固定设置的仪器因限制了电压设置的更改，从而可以实现实验流程的简化。
不固定或可调整的电压设置更适用于运行多色实验方案的用户。固定电压设置是为检测小型多色方案的发射荧光而预先设定。而可调整的电压设置则不局限于一组荧光染料组合，因此适用于采用更大实验方案或更多种类染料的用户。此外，可调整的电压设置还可使用户检查单染色阳性对照，从而将其光电倍增管（PMT）信号调整至刻度范围内。作为多参数流式细胞术实验的一部分，通过调整光电倍增管（PMT）电压还可获得最佳信号补偿。
荧光补偿
图 15. 荧光补偿。 (A)重叠发射信号可产生假阳性数据。 ( B )通过补偿数据去除了重叠的发射荧光。补偿调节后的数据将产生更准确的结果。
多种荧光染料的发射产生一系列可见光。从多色荧光染料组合收集得到的数据将具有重叠的荧光信号。这可能导致单个染料标记的阳性细胞作为双阳性细胞出现。
图 16. 补偿技术。 (A)传统补偿技术采用经充分研究的系列算法组合，分析来自荧光基团、阴性设门或未染色对照的数据，从而将重叠发射光转变为单色光。 (B)混合光谱分解技术采用约束泊松回归或非负矩阵分解等算法，将重叠发射光转变为单色光。
补偿是指利用一系列算法分离每个荧光染料的信号的过程。传统补偿技术分离特定波长：首先单独检测每个荧光染料，然后利用算法创建校正值矩阵；这些校正值会用于光谱重叠，以产生独立的数值。此过程可简单、快速地计算信号补偿。
与传统补偿技术相比，全光谱解析技术的不同之处在于可提供单个波长的发射光谱。
实验中的通道和荧光染料数量
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图 17. 荧光通道。 (A) 单激光系统可以具有多个通道。 ( B )发射光发生重叠且需要补偿。 ( C )3激光系统配备了更多检测器，因此具有更多荧光通道。 ( D )通道增多，使得荧光染料选择增多且所需补偿减少。
捕获光电倍增管（ PMT）和雪崩光电二极管（APD）中发射光的元件被称为荧光通道。流式细胞仪检测到的荧光染料数由可用荧光通道的数量决定。
单激光系统可以具有多个荧光通道。这意味着单激光器可激发多种荧光染料，并且检测器可捕获样品在不同波长处的发射光。但这类实验通常需要复杂的补偿，因为所有荧光染料的发射光谱都有重叠。
多激光器的优势在于具有更多荧光通道。多通道可使荧光染料选择增多，所需补偿减少，多色实验设计也相对容易。此外，还可提高实验的细胞群体分辨率。
仪器维护
流式细胞仪是一种持久耐用的精密仪器， 其大部分组件都是永久性固定装置。定期维护和常规清洗可最大限度减少其零件更换，并且有助于获得高质量数据。
仪器清洁和维护的重要性
图 18. 因维护不当产生的常见污染物 ( A )残留物指来自之前样品的细胞或颗粒污染物。 ( B )与核酸结合的染料是粘性的并且可产生背景噪音。 ( C )微生物可在流式细胞仪的液流瓶和其他组件内生长。
如果不对仪器进行定期清洗，会出现以往样品材料不断累积的问题。
以往样品的残留细胞问题是灵敏性实验的一大障碍，如检测稀有细胞； 它会使假阳性率升高。通过在不同样品进样之间或实验结束后对管道进行冲洗，可减少先前实验残留的细胞或颗粒数量。
定期清洗可防止荧光染料累积；某些染料（如核酸染料）更易于发生累积。粘性染料、细胞和碎片的积聚会增加管道堵塞几率。运行细胞培养物或组织样品的仪器更容易发生细菌污染；其标志包括废液瓶中出现浑浊液体，以及空白样品中的事件积聚数量增加。可根据生产说明书，使用洗涤液或漂白剂冲洗整个管路系统，防止微生物生长。
常规清洗
图 19. 每日清洗。 ( A )在不同样品进样之间，使用漂白液和去离子水冲洗管道。部分仪器可以自动进行清洗。 ( B )开机启动和每日关机清洗程序有助于防止染料和细胞残留物的累积。 ( C )其他日常维护检查涉及由软件引导的自动化清洗方案。
通过管路清洗可最大限度减少样品间的污染。不同用户进行实验时，大多数制造商都会建议用户在运行下一个实验之前依次使用10%漂白液和去离子水冲洗管道。部分仪器可在不同样品进样之间进行自动清洗。
大部分系统需要在使用前和每日工作结束时使用去离子水和洗涤液进行冲洗，以去除流式细胞仪管道和流动室中残留的细胞和染料。有关开机启动和关机清洗方案的详细介绍，多见于用户手册。日常维护有助于确保液流管道和流动室不含微生物或残留样品的污染物。
部分流式细胞仪还有其他每日维护要求，包括液体室处理、检查过滤器中的气泡以及排空废液桶。部分流式细胞仪还具有由软件引导的自动化清洗方案。该自动化系统通过删减某些操作任务，如气泡检查或关机程序，可减少用户工作量。总之，这些方案都可节省时间并实现合理的管路清洗。
液路去污
图 20. 液流系统维护。 ( A–F )清洗或更换流式细胞仪零件，以维护正常仪器性能并最大限度减少残留物、背景噪音和微生物污染。
通过结合液路冲洗、鞘液过滤器更换和深度仪器清洗程序，可去除残留物、荧光染料和微生物。大部分流式细胞仪需要每2周至每月对鞘液管、废液管、液流瓶和流动室进行一次深度清洗，以防止碎片累积并清除生物危害性材料和微生物。
根据液流系统的类型，确定是否需要取出和更换或清洗组件。蠕动泵系统需要每6个月至每年取出和更换一次蠕动管。若不更换，污染物或碎片则会在事件收集过程中不断积累。气压泵系统需要定期维护喷嘴及相关零件，以便样品能够快速进入流式细胞仪。注射泵系统也需要清洗注射器，以减少污染细胞。注意遵循用户手册和日志维护，以确保数据的完整性。
技术参数对比文档
技术参数表的用途
流式细胞仪制造商提供的技术参数表（技术参数或参数表）描述了仪器的主要性能特点，可为想要购买流式细胞仪的用户提供大量信息。 然而，尽管采用相同的术语，但不同技术参数表因使用的数值计算方法不同，亦会难以对比。
技术参数表可辅助了解流式细胞仪的设计特点，如性能、尺寸大小、环境和软件，从而确定仪器是否适合您的研究。
多家制造商的仪器参数比较
比较各种技术参数可能具有挑战性，因为尽管使用相同的术语，但不同厂家的计算方式可能不同。这份白皮书为如何解读这些变化提供了有用的信息。
技术参数可作为对比的基础，辅助评估不同仪器的性价比。技术参数表还可助您了解制造商所保证的仪器性能。因此，您可充分了解仪器标明的价值以及是否符合您的预期用途。在使用技术参数表作为仪器对比指南时，应进行全面彻底的了解。不同仪器间，许多性能值看似接近，实际却大有不同。参数数值均来自于特定的测试或计算，但是不同仪器开发商采用的测试方法并不相同，因此可能导致错误的横向对比。
不同制造商提供的技术参数表分节也可能大不相同，进一步增加了差异性。图1-8以 Invitrogen Attune NxT流式细胞仪的技术参数表为例，描述了常见的发布信息分类。该表讨论了在流式细胞仪评估阶段需要特别注意的主要参数，包括关于如何破解差异的实用技巧。
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图 1. 液流系统。 流式细胞仪的液流系统将样品管中的样品输送至流动室。样品通过流动室（并通过激光和检测器）后，则被运送到废液中。技术参数表中的液流系统部分提供了关于样品、体积、流速、流动室和液体容量的信息。
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图 2. 光学系统。 作为分析平台，流式细胞术依赖于激光对单个细胞的激发以及对产生荧光和散射光的信号收集。光学元件可处理仪器内的光照和光线收集。技术参数表中的光学系统部分概述了光学系统相关参数，如激光器类型和功率、激光分布、激光对准和光电倍增管（PMT）。
特别注意：激光功率
单位为mW
功率参数常被定义为由激光制造商发布的激光输出量（ 图2 ）。 但是，标明的功率值并不一定与检测点的实际输出功率相一致、相对应，因为光线在激光器和流动室之间的光学元件内损失可能很大。而且不同系统的光损失也各不相同。高度光损失表示部分激光功率在实验中未被充分利用；光损失减少表示流动室的激光强度增加，导致荧光染料的激发增强和灵敏度升高。由于存在这些差异性，所以即使技术参数表上的激光功率数值较高，也并不代表该仪器比其他仪器更灵敏。
如何进行对比
在对比仪器时，应谨慎对待这些参数数值。大部分制造商不会报告到达流动室时的实际功率，但要知道这正是需要对比之处。
特别注意：针孔和激光对准设计
此参数（并非每个制造商都会报告）是指决定是否每个激光器生成的荧光信号均在检测器（也称PMT）上被分离的针孔数量。选择时，您需了解激光器是根据内部针孔呈空间立体排列还是共线排列。针孔可实现荧光染料的最大激发并将激光光线的交叉干扰降至最低。许多流式细胞仪制造商采用共线激光装置。当激光器以共线形式对准通过单个针孔，来自多个激光器的信号则共用同一条光路。这种配置意味着，由不同激光器激发的多种染料的信号将被同一个检测器检测，这会影响补偿值并导致分析困难。 此外，还存在对对准问题敏感（如果光束未完全共线，会增加重合率）或对弱荧光检测灵敏度低的问题。另一种可选设计为空间立体排布系统 (图2 )。这种配置具有多种优势，包括无对准问题、具有更多激光颜色选择以及减少多色实验中的补偿问题。
如何进行对比
务必了解每个针孔对应的激光器类型和数量，并确定系统采用的是空间立体排布还是共线激光器。
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图 3. 性能。 在制造商广泛发布的标准参数中，技术参数表的性能部分包含几种常见特性，如MESF计算、数据采集速率以及前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）参数。
特别注意：最大事件率或理论最大事件率
单位为事件数/秒
事件率是指单位时间内通过仪器检测点的细胞或颗粒的实际数量。有两种几乎完全不同的方法可用于确定该数值，通常都采用相同的单位表示（即事件数/秒）。 这两种事件率的计算方法为：
- 评估电子元件处理事件的最高速度
- 评估达到指定重合率时的最大事件率
了解制造商如何计算技术参数表中的该数值十分重要！
方法1
此方法为理论意义上的方法，它忽略了重合率以及其他仪器设计特点，如液流系统。因此，尽管电子元件能够以 10,000–100,000事件数/秒的速度处理事件，但根据泊松分布，该事件率对应的重合率可能远远超过普遍接受的10%的上限。近年来，随着更快速（但不一定是更高质量的）电子元件的出现，这种事件率参数的计算方式正日益受到认可；但注意，这种事件率的计算方式并未考虑重合事件。
方法2
此种仪器事件率的计算方法是基于10%重合率水平，这对研究人员来说更有意义( 图3 )。重合率越低，表示数据完整度越高。因此，使用这种方法最能代表可用于生成高质量数据的实际事件率对应的可接受重合率。若制造商使用该方法计算事件率参数，则用户可以更加确信数据在指定事件率对应的可接受重合率水平范围内。
如何进行对比
在对比仪器时，您应确保了解制造商采用何种方法计算事件率参数数值。制造商如使用第一种方法（电子元件处理速度）进行计算，您需在运行样品时注意重合率的问题。
特别注意：残留率
遗留率是指遗留并污染下一个样品的原始样品量，样品遗留将导致数据不准确( 图3 )。 遗留率的测量方法通常是先获取样品的固定体积，再获取无颗粒缓冲液（如，磷酸盐缓冲生理盐水（PBS））的固定体积。 随后，鉴别缓冲液中代表污染细胞的事件。 许多制造商通过运行特定细胞系或磁珠，确定指定条件下的遗留率数值。
如何进行对比
了解具体的指定条件以及使用哪种样品确定残留率数值十分重要。例如，参数测试所用的洗涤次数或者颗粒或细胞的大小或类型，可能与研究人员所用的完全不同。咨询制造商如何计算其残留率数值。了解不同制造商使用的不同计算方法，可助您根据参数值直接对比残留率。
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图 4. 软件。 技术参数表的软件部分可使研究人员了解系统内置软件的功能和特点。 该部分还对功能范围、用户定义功能、维护特点以及用户账户管理进行了说明。不同制造商生产的仪器具有不同的软件特点，有些系统配有独特的专有功能选项。
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图 5. 质量控制和监管。 质量控制和监管参数是指制造完整性、保修、现场安装工程程序和ISO认证。
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图 6. 数据管理。 数据管理部分对于成功的计算机安装和设置至关重要。 这一部分详述了RAM、硬盘驱动和FSC格式等规格。
特别注意：操作温度
单位为°C或°F
该参数常被忽视，但对仪器的终身使用价值非常重要，因为光学对准和液流系统与这些数值都密切相关( 图7 )。
如何进行对比
确定实验室是否处于相对恒定的温度以及仪器是否会在不同地方进行使用。仪器性能仅在规定温度范围内经过测试且具有保证，因此一定要注意操作条件。
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图 7. 安装条件。 标准装机条件部分描述了仪器的环境影响、操作条件和占地等信息。
特别注意：尺寸和重量
高 × 宽 × 深，单位为厘米（cm）或英寸（in.）；仪器重量单位为千克（kg）或磅（lb）
考虑仪器是否能够放置在通风橱内的预定空间或区域内。务必考虑自动采样器等配件的空间要求，并了解液流系统是否需要空间( 图7 )。许多流式细胞仪都具有外部液流装置，这大大增加了仪器所需的整体空间。如果仪器需要定期转移，应考虑其困难性。应注意，并非所有台式仪器都具有相同的空间需求或可转移性。
如何进行对比
在仪器演示时，应要求查看已安装所有组件的完整系统，从而可以直接对比每个系统所需的实际空间。
特别注意：微孔板分析速度
单位为分钟/96或384孔板
微孔板分析速度通常是指完整分析一个96或384孔板所需的时间( 图8 )。该定义包含两方面内容：一、样品体积；二、样品处理速度。应注意，该参数中报告的时间值越低，可能代表数据质量的损失越大。同时，务必明确在计算该数值时所用的分析样品体积以及样品处理速度。有些制造商展示的是通过收集小体积样品而最大限度减少微孔板处理时间的参数图。但这种操作实际上需要高度浓缩的样品，并会导致产生数据质量问题，如较高的重合率和丢失率。反之如果样品浓度不足，则小体积进样可能导致事件数过少而不具有统计学意义。
样品处理速度（样品进入液流系统的速度）还会影响数据质量。在采用流体动力学聚焦技术的流式细胞仪中，当流速增加时样品轴流会变宽并会造成细胞更广的分布（图2）。样品处理速度升高，将导致变异系数增大、检测精确度降低以及数据质量降低。在采用声波辅助流体动力学聚焦技术的仪器中，细胞紧密排列在细胞流的中心，不受样品处理速度的影响，所以信号变异系数更低，数据质量更高。因此，如果需要通过提高样品进样速度来缩短微孔板的处理时间，应选择采用声波聚焦技术的仪器，以避免数据质量降低。
微孔板分析速度的另一个影响因素是在不同样品进样之间是否冲洗进样针的问题。冲洗进针会延迟微孔板的分析时间，但不冲洗进样针可能会增加残留率—这是在指定参数条件下运行实验前需要考虑的一个因素。
如何进行对比
务必了解达到制造商技术参数表所述时间可能产生的数据质量损失。
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图 8. 进样器参数。 进样设备是流式细胞仪的配件。其参数包括采集时间、残留率和混合方法。其他信息还可能包括兼容的微孔板类型以及液流系统的选择。
结论
务必咨询与指定参数数值相关的测试，从而确保您准确比较仪器的性能。
流式细胞仪液流系统的硬件组成
流式细胞术是对液体中单个悬浮细胞或其他微粒进行多参数分析的一门实验技术。相较于成像和PCR等其他方法，因其细胞流或微粒流可收集样品中单个细胞的信息，所以具有明显优势。需注意，样品进入仪器并被输送至光学系统的过程需成熟、精湛技术的支持。
液流系统的重要性
流式细胞术的强大之处在于能够对异质细胞群中单个细胞的物理特性进行定量分析。这一过程需要液流系统将大量细胞输送至流式细胞仪器中，以产生具有统计学意义的数据。为获得准确的计数和测量，进入和流过仪器的细胞流必须保持稳定、一致。
高速上样时的重合事件
图 1. 重合率。 (A)一个细胞被激光束激发。 (B)两个细胞被激光束激发，产生双重信号。 双重或三重细胞信号会掩盖样品的真实生物特性。
细胞以混乱无序的方式进入流式细胞仪。理想状态下，它们排成单列通过激光检测点，从而实现单个细胞检测。但在某些情况下，细胞会一起流过激光检测点（基于泊松分布或者样品含有细胞团块）。 而当一个以上细胞同时出现在激光检测点时，则称为重合事件 。
两个细胞同时通过激光束，会导致难以区分目标细胞。如果其中一个细胞是阳性，另一个细胞是阴性，仪器会将该事件视为阳性信号。这种情况下，从该事件获得的数据即为重合事件，且数据不可信。液流聚焦技术为在光学系统中实现单个细胞检测提供了可能性。
液体输送系统
图 2. 将细胞输送进流式细胞仪的系统。( A )基于压力的液流系统利用样品流与样品流周围鞘液流的压力差进行运行。 ( B )基于体积的液流系统可测定准确的样品体积，从而实现浓度和绝对计数检测。
基于压力和基于体积的液流系统是细胞进入流式细胞仪的两种常见机制。
含有大量细胞的样品可以通过气压泵液流系统快速进入仪器：首先，使用特殊样品管形成密封环境，产生增压系统。然后，密封的样品管会促使样品与仪器鞘液之间产生压力差，从而将细胞送入光学系统。该系统的优势在于：可平稳输送样品、输送大体积样品并降低样品溢漏风险。缺点是存在反压问题，如果维护不当，容易发生管路堵塞。
基于体积的液流系统可实现更灵活的细胞输送，它采用了测量样品精确体积并将其注入仪器的机制。该系统的优势包括可进行绝对细胞计数和处理难分离样品，包括粘性细胞或大细胞，这是因为它不易发生管路堵塞。此外，该系统可使用任何类型的样品管或微孔板进行上样，因此具有更高使用价值。
样品输送系统
图 3. 两种类型的泵。 (A)蠕动泵利用旋转头系统输送液体。 旋转头中的转子向管道施压，驱使液体向前流动。 (B注射泵抽取样品并将其注射到流体系统中。
基于压力和体积的系统利用蠕动泵或注射泵完成样品输送。
对于不太昂贵的仪器来说，蠕动泵是一种常见的低成本选择。配有这类泵的液流系统利用一系列转动轴挤压管道而输送液体。它可快速输送大体积样品。但是，该技术无法提供准确的细胞计数，因为输送到仪器中的样品量随泵的旋转而上下波动。
基于体积的输送系统采用注射泵，从而可以精确控制和测量样品体积。 注射泵能实现绝对细胞计数和样品回收。其回收的样品可用于其他实验，如PCR和成像实验，或可再次储存以便用于下次实验。体积样品输送是一种高品质、精心设计的输送系统，可将细胞精确输送至仪器中。
使悬浮细胞流入光学系统的技术
图 4. 细胞聚焦系统。
仪器可采用不同的流体学方法采集流过光学系统的单个细胞。
大多数流式细胞仪采用传统流体学聚焦技术，如流体动力学聚焦。 该技术利用鞘液与细胞样品间的压力差和速度差，推动细胞向前流动。
部分流体学系统采用声波辅助流体动力学聚焦。该聚焦技术是对传统系统的进一步改良，利用声波将细胞聚焦于流动室的中央，再利用传统流体动力学技术将细胞输送到光学系统中。声波聚焦技术不仅可以减少液体使用量，还可保留流体动力学聚焦的优势。通过将声波聚焦和鞘液结合使用，可将细胞排成单列，从而实现更快的上样速度和更低的重合率。而鞘液的使用量少也有利于保持流动室清洁并降低管路堵塞风险。该技术上样速度快，特别适合于检测大体积稀释样品。
样品处理
压力液流系统使用流式管进样，大多情况下一次只能处理一个样品。 对于高通量应用，这些流式细胞仪可装配独立的多孔上样器。有些型号的仪器需要使用特殊样品制造压力差，才能使样品进入流式细胞仪，因此不适合使用多孔板采样。
基于体积的流式细胞仪使用样品管和多孔板均可以完成进样。移液管式注射器可将样品混匀并注射到仪器中。
多孔板采样器可与机械臂连接，用于高通量处理多个微孔板。这些系统具有更强大的液流系统，支持多孔板的持续运行，因此可处理大批量样品。
流式细胞仪的光学元件选择
流式细胞仪中的光学系统可直接影响实验的设计和运行。其中，激光器为激发与抗体或试剂偶联的荧光染料提供光源，以用于检测和分析各种细胞组分及特性。检测器用于捕获特定波长的光并将其放大和分离，从而提供待测荧光染料的详细特定物理特性信息。激光器和检测器技术决定了实验所用荧光染料的数量和类型。因此，为获得最佳数据，有必要了解多种光学系统元件。
光学系统的重要性
对单个细胞及其物理特性的鉴定情况取决于激光器的能量和检测系统的灵敏度。大部分实验需要使用多种荧光染料标记细胞表面和细胞内蛋白质，以便鉴定细胞群体、细胞周期、群体倍增数、凋亡和细胞活性等。良好的光学系统和高品质元件可全面捕获细胞的生物学和生物化学特性。
光学系统的灵敏度和光谱范围对于检测荧光染料的发射光非常重要
荧光染料的激发波长和发射波长
图 5. 荧光染料的激发波长和发射波长。 ( A )具有多种荧光标记的细胞。 ( B )PE和FITC均由蓝色 488 nm激光激发，具有重叠的发射光谱。 ( C ) 黄色 561 nm激光可激发PE，但不能激发FITC。 ( D ) Alexa Fluor 647染料由红色640 nm激光激发。
光谱重叠（荧光重叠）
图 6. 双重激发最大波长。 (A) PE可由488 nm激光激发。 (B) PE还可由最大激发波长为561nm的激光激发。 使用该激光激发PE，能使其更高效地发射荧光。
有些荧光染料具有多种激发波长，其激发效率也有所不同。例如，蓝色488和黄色561 nm激光都能激发荧光染料PE。蓝色488激光可在低能级激发PE。黄色561 nm激光可为荧光染料提供更多的激发能量，从而产生更多的发射光子。强发射光可分辨数量少的、表达低的细胞群体，而使用不配备黄色561nm激光的仪器可能无法观察到这些群体。
光学元件技术
激光器
图 7. 常用荧光蛋白和染料的激光波长。
市售流式细胞仪一般配有紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、绿色（532 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）等激光器 。基础配置通常包含蓝色488 nm激光器。增加激光器可为增加实验所用荧光染料数提供可行性。紫色、蓝色、黄绿和红色激光器足以用于激发多色实验所用的大部分荧光染料。此外，有些流式细胞仪还配有350 nm范围内的紫外激光器，以扩大多色实验的激发和发射波长选择范围。
激光分布图
图 8. 激光对准。 (A)细胞接收到正确对准激光器的的全部激光能量。这可确保每个细胞都具有相等的荧光染料激发能量，从而减少数据差异。( B )激光未对准可能导致荧光染料激发能量的分布不均；增大数据差异。
为比较实验中不同细胞间的发射荧光信号，应确保每个细胞接收到相等的激光激发能量。正确的激光对准将产生一致的激光束输出，有助于为通过激光检测点的每个细胞提供最佳信号。对准激光束产生的数据具有生物学差异，而非仪器差异。
在弱表达细胞样品中，次优级激发能量可能产生阴性结果。激光能量不一致，会导致从细胞中收集的发射信号产生较大差异，进而造成更大的统计错误。而激光对准偏移，可能会使流过激光束的每个细胞接收到较少或不均等的激发能量。
图 9. 激光分布图。 (A)高斯发射分布图。光子在中心位置密集分布且最强烈。( B )平顶光斑激光器覆盖了更大和更多平坦区域。细胞可通过更宽的峰顶而产生荧光。
大部分流式细胞仪采用高斯分布激光器。细胞必须通过光束中心，才能获得最佳激发能量。
最新开发的平顶光斑激光器覆盖了更大的荧光染料激发区域。其更宽的峰顶使样品中的细胞能够均匀利用能量，有助于产生一致的检测结果。
激光装置
图 10. 激光装置。 (A)共线激光装置利用多个激光器聚焦于同一个激光检测点。 ( B )空间分离的激光装置呈单个排列，依次聚焦于通过激光检测点的细胞。
仪器中的多个激光器排布通常采用两种排列方式 。激光装置会影响实验所用的荧光染料数量以及细胞荧光的检测。
共线装置的所有激光器同时发射激光，并聚焦于同一区域，从而同时激发多种不同荧光染料。
因多种荧光信号同时发射且需要更多补偿，这种激光装置的多色组合设计灵活性较低。共线激光装置适用于两种不同波长的激光器，用于激发几乎没有或没有重叠发射光谱的荧光染料。经济型流式细胞仪可能会采用这种激光装置，以节省光学元件成本。
空间分离装置依次激发细胞流；使用多种荧光染色的细胞依次通过各个激光束，每个检测器分别激发和检测发射光谱。使用这类装置的优势在于：可灵活选择实验所用的染料数量；此外，独立发射的荧光信号具有更高的灵敏度并且需要更少的补偿；该装置在相近发射光谱中产生的荧光重叠大大减少，因此可以更容易地创建多色实验方案。
荧光分离元件
图 11. 荧光发射光谱。 (A)荧光染料受激发后在有限的波长范围内发出荧光。 ( B )有些荧光染料之间具有重叠的发射光谱。
荧光染料受激发后在一定的光谱范围内发光，而不是在特定波长发光。发射荧光通常需要通过光学滤光片 ，才能被捕获和分析。若不经过荧光分离，未过滤的多种荧光会发生重叠，导致结果难以分析。
图 12. 荧光分离元件。 (A)光学滤光片根据荧光波长范围分离荧光染料的发射信号。 ( B )棱镜单色仪阵列将光线分到不同波长区域，并将这些区域的光聚焦到不同检测器上。
基于光学滤光片的不断开发，如今已可对使用多种荧光偶联抗体标记的细胞进行分析。这些荧光分离元件易于获取且可更换，最常用于流式细胞仪中的荧光分离。通过组合不同的滤光片，可设计各种颜色组合，从而创建小型或大型的多色方案。这是一个经过检验的可靠系统，并具有持久耐用的元件。我们希望此类系统的滤光片易于更换，以方便不同的染料组合使用。
光谱流式细胞术与传统流式细胞术有所不同；光谱流式细胞仪利用棱镜聚焦可见光谱内的发射荧光。来自多种荧光染料的发射光会发生重叠，所以需要复杂的算法进行进一步分离。而该技术的优势在于它为有限的激光器提供了更多颜色通道。该技术仍处于开发阶段，并且某些荧光染料的计算荧光分离技术较为有限。
发射检测器
图 13. 发射光检测元件。 (A)PTM捕获并放大荧光染料发射的信号。 ( B )APD捕获半导体上的光子并放大信号。
来自单个细胞的发射荧光信号较弱。为方便分析，需要将发射光转换为一种可调整的数据格式。为此， 发射检测设备捕获荧光并将光波转换为电子信号；并将独立的电子信号放大，获得可供用户处理的数据。
光电倍增管（PMT）是为大多数流式细胞仪所采用的检测设备；多个光电倍增管（PMT）排列在光路末端，可捕获每个经过滤的荧光信号。因其可以在从紫外到红外的广泛光谱范围内以线性方式捕获荧光的动态范围—非常微弱到非常明亮的信号范围，所以非常适用于多色组合实验。
其他检测设备还包括用于引导和放大发射荧光生成电子的雪崩光电二极管（APD）。对于主要检测远红外光谱内的荧光染料发射光的实验，它们可高效捕获在红外和近红外光谱区域内发射的信号。
电压设置
图 14. 电压设置。 (A)由于光电倍增管（ PMT）电压过高，使得荧光染料标记细胞的阳性发射信号不在可检测范围内并且超出刻度范围。 ( B )降低电压后，可检测到阳性信号。
在流式检测中，样品背景可能来自于细胞或样品其他成分的自发荧光。如要实现染色细胞物理特性的全面可视化，需要捕获阳性信号中的全部阴性（昏暗）信号。也就是说，需调整至理想的光电倍增管（ PMT）电压，使相关染色的荧光信号与细胞的可检测（阴性）自发荧光实现最佳分离。
在运行细胞样品前，应使用荧光标准品优化流式细胞仪的光电倍增管（PMT）电压，以计算每个光电倍增管（PMT）的最佳电压。
可根据需要调整光电倍增管（PMT）电压，特别是在阳性信号过亮的情况下。调整时，用户可使用未染色的对照细胞作为背景信号的阴性对照。而对光电倍增管（PMT）电压进行降低操作，可实现合适的阳性信号检测并降低阴性群体的强度值。
流式细胞仪检测到的荧光信号数量也会受电压设置的影响。设置更高或更低的电压，会在光电倍增管（ PMT）检测器上产生更多或更少的增益，从而实现合适的荧光信号检测。
固定电压设置是简单流式细胞仪功能的一部分，因此简单流式细胞仪的可检测发射荧光范围有限。调整电压设置可能比较困难，因为用户需要区分阳性细胞群体与背景信号。新用户可能会设置过高或过低的电压。为帮助这些用户，小型多色实验方案及其相关检测器的电压会被锁定。 具有固定设置的仪器因限制了电压设置的更改，从而可以实现实验流程的简化。
不固定或可调整的电压设置更适用于运行多色实验方案的用户。固定电压设置是为检测小型多色方案的发射荧光而预先设定。而可调整的电压设置则不局限于一组荧光染料组合，因此适用于采用更大实验方案或更多种类染料的用户。此外，可调整的电压设置还可使用户检查单染色阳性对照，从而将其光电倍增管（PMT）信号调整至刻度范围内。作为多参数流式细胞术实验的一部分，通过调整光电倍增管（PMT）电压还可获得最佳信号补偿。
荧光补偿
图 15. 荧光补偿。 (A)重叠发射信号可产生假阳性数据。 ( B )通过补偿数据去除了重叠的发射荧光。补偿调节后的数据将产生更准确的结果。
多种荧光染料的发射产生一系列可见光。从多色荧光染料组合收集得到的数据将具有重叠的荧光信号。这可能导致单个染料标记的阳性细胞作为双阳性细胞出现。
图 16. 补偿技术。 (A)传统补偿技术采用经充分研究的系列算法组合，分析来自荧光基团、阴性设门或未染色对照的数据，从而将重叠发射光转变为单色光。 (B)混合光谱分解技术采用约束泊松回归或非负矩阵分解等算法，将重叠发射光转变为单色光。
补偿是指利用一系列算法分离每个荧光染料的信号的过程。传统补偿技术分离特定波长：首先单独检测每个荧光染料，然后利用算法创建校正值矩阵；这些校正值会用于光谱重叠，以产生独立的数值。此过程可简单、快速地计算信号补偿。
与传统补偿技术相比，全光谱解析技术的不同之处在于可提供单个波长的发射光谱。
实验中的通道和荧光染料数量
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图 17. 荧光通道。 (A) 单激光系统可以具有多个通道。 ( B )发射光发生重叠且需要补偿。 ( C )3激光系统配备了更多检测器，因此具有更多荧光通道。 ( D )通道增多，使得荧光染料选择增多且所需补偿减少。
捕获光电倍增管（ PMT）和雪崩光电二极管（APD）中发射光的元件被称为荧光通道。流式细胞仪检测到的荧光染料数由可用荧光通道的数量决定。
单激光系统可以具有多个荧光通道。这意味着单激光器可激发多种荧光染料，并且检测器可捕获样品在不同波长处的发射光。但这类实验通常需要复杂的补偿，因为所有荧光染料的发射光谱都有重叠。
多激光器的优势在于具有更多荧光通道。多通道可使荧光染料选择增多，所需补偿减少，多色实验设计也相对容易。此外，还可提高实验的细胞群体分辨率。
仪器维护
流式细胞仪是一种持久耐用的精密仪器， 其大部分组件都是永久性固定装置。定期维护和常规清洗可最大限度减少其零件更换，并且有助于获得高质量数据。
仪器清洁和维护的重要性
图 18. 因维护不当产生的常见污染物 ( A )残留物指来自之前样品的细胞或颗粒污染物。 ( B )与核酸结合的染料是粘性的并且可产生背景噪音。 ( C )微生物可在流式细胞仪的液流瓶和其他组件内生长。
如果不对仪器进行定期清洗，会出现以往样品材料不断累积的问题。
以往样品的残留细胞问题是灵敏性实验的一大障碍，如检测稀有细胞； 它会使假阳性率升高。通过在不同样品进样之间或实验结束后对管道进行冲洗，可减少先前实验残留的细胞或颗粒数量。
定期清洗可防止荧光染料累积；某些染料（如核酸染料）更易于发生累积。粘性染料、细胞和碎片的积聚会增加管道堵塞几率。运行细胞培养物或组织样品的仪器更容易发生细菌污染；其标志包括废液瓶中出现浑浊液体，以及空白样品中的事件积聚数量增加。可根据生产说明书，使用洗涤液或漂白剂冲洗整个管路系统，防止微生物生长。
常规清洗
图 19. 每日清洗。 ( A )在不同样品进样之间，使用漂白液和去离子水冲洗管道。部分仪器可以自动进行清洗。 ( B )开机启动和每日关机清洗程序有助于防止染料和细胞残留物的累积。 ( C )其他日常维护检查涉及由软件引导的自动化清洗方案。
通过管路清洗可最大限度减少样品间的污染。不同用户进行实验时，大多数制造商都会建议用户在运行下一个实验之前依次使用10%漂白液和去离子水冲洗管道。部分仪器可在不同样品进样之间进行自动清洗。
大部分系统需要在使用前和每日工作结束时使用去离子水和洗涤液进行冲洗，以去除流式细胞仪管道和流动室中残留的细胞和染料。有关开机启动和关机清洗方案的详细介绍，多见于用户手册。日常维护有助于确保液流管道和流动室不含微生物或残留样品的污染物。
部分流式细胞仪还有其他每日维护要求，包括液体室处理、检查过滤器中的气泡以及排空废液桶。部分流式细胞仪还具有由软件引导的自动化清洗方案。该自动化系统通过删减某些操作任务，如气泡检查或关机程序，可减少用户工作量。总之，这些方案都可节省时间并实现合理的管路清洗。
液路去污
图 20. 液流系统维护。 ( A–F )清洗或更换流式细胞仪零件，以维护正常仪器性能并最大限度减少残留物、背景噪音和微生物污染。
通过结合液路冲洗、鞘液过滤器更换和深度仪器清洗程序，可去除残留物、荧光染料和微生物。大部分流式细胞仪需要每2周至每月对鞘液管、废液管、液流瓶和流动室进行一次深度清洗，以防止碎片累积并清除生物危害性材料和微生物。
根据液流系统的类型，确定是否需要取出和更换或清洗组件。蠕动泵系统需要每6个月至每年取出和更换一次蠕动管。若不更换，污染物或碎片则会在事件收集过程中不断积累。气压泵系统需要定期维护喷嘴及相关零件，以便样品能够快速进入流式细胞仪。注射泵系统也需要清洗注射器，以减少污染细胞。注意遵循用户手册和日志维护，以确保数据的完整性。
技术参数对比文档
技术参数表的用途
流式细胞仪制造商提供的技术参数表（技术参数或参数表）描述了仪器的主要性能特点，可为想要购买流式细胞仪的用户提供大量信息。 然而，尽管采用相同的术语，但不同技术参数表因使用的数值计算方法不同，亦会难以对比。
技术参数表可辅助了解流式细胞仪的设计特点，如性能、尺寸大小、环境和软件，从而确定仪器是否适合您的研究。
多家制造商的仪器参数比较
比较各种技术参数可能具有挑战性，因为尽管使用相同的术语，但不同厂家的计算方式可能不同。这份白皮书为如何解读这些变化提供了有用的信息。
技术参数可作为对比的基础，辅助评估不同仪器的性价比。技术参数表还可助您了解制造商所保证的仪器性能。因此，您可充分了解仪器标明的价值以及是否符合您的预期用途。在使用技术参数表作为仪器对比指南时，应进行全面彻底的了解。不同仪器间，许多性能值看似接近，实际却大有不同。参数数值均来自于特定的测试或计算，但是不同仪器开发商采用的测试方法并不相同，因此可能导致错误的横向对比。
不同制造商提供的技术参数表分节也可能大不相同，进一步增加了差异性。图1-8以 Invitrogen Attune NxT流式细胞仪的技术参数表为例，描述了常见的发布信息分类。该表讨论了在流式细胞仪评估阶段需要特别注意的主要参数，包括关于如何破解差异的实用技巧。
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图 1. 液流系统。 流式细胞仪的液流系统将样品管中的样品输送至流动室。样品通过流动室（并通过激光和检测器）后，则被运送到废液中。技术参数表中的液流系统部分提供了关于样品、体积、流速、流动室和液体容量的信息。
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图 2. 光学系统。 作为分析平台，流式细胞术依赖于激光对单个细胞的激发以及对产生荧光和散射光的信号收集。光学元件可处理仪器内的光照和光线收集。技术参数表中的光学系统部分概述了光学系统相关参数，如激光器类型和功率、激光分布、激光对准和光电倍增管（PMT）。
特别注意：激光功率
单位为mW
功率参数常被定义为由激光制造商发布的激光输出量（ 图2 ）。 但是，标明的功率值并不一定与检测点的实际输出功率相一致、相对应，因为光线在激光器和流动室之间的光学元件内损失可能很大。而且不同系统的光损失也各不相同。高度光损失表示部分激光功率在实验中未被充分利用；光损失减少表示流动室的激光强度增加，导致荧光染料的激发增强和灵敏度升高。由于存在这些差异性，所以即使技术参数表上的激光功率数值较高，也并不代表该仪器比其他仪器更灵敏。
如何进行对比
在对比仪器时，应谨慎对待这些参数数值。大部分制造商不会报告到达流动室时的实际功率，但要知道这正是需要对比之处。
特别注意：针孔和激光对准设计
此参数（并非每个制造商都会报告）是指决定是否每个激光器生成的荧光信号均在检测器（也称PMT）上被分离的针孔数量。选择时，您需了解激光器是根据内部针孔呈空间立体排列还是共线排列。针孔可实现荧光染料的最大激发并将激光光线的交叉干扰降至最低。许多流式细胞仪制造商采用共线激光装置。当激光器以共线形式对准通过单个针孔，来自多个激光器的信号则共用同一条光路。这种配置意味着，由不同激光器激发的多种染料的信号将被同一个检测器检测，这会影响补偿值并导致分析困难。 此外，还存在对对准问题敏感（如果光束未完全共线，会增加重合率）或对弱荧光检测灵敏度低的问题。另一种可选设计为空间立体排布系统 (图2 )。这种配置具有多种优势，包括无对准问题、具有更多激光颜色选择以及减少多色实验中的补偿问题。
如何进行对比
务必了解每个针孔对应的激光器类型和数量，并确定系统采用的是空间立体排布还是共线激光器。
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图 3. 性能。 在制造商广泛发布的标准参数中，技术参数表的性能部分包含几种常见特性，如MESF计算、数据采集速率以及前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）参数。
特别注意：最大事件率或理论最大事件率
单位为事件数/秒
事件率是指单位时间内通过仪器检测点的细胞或颗粒的实际数量。有两种几乎完全不同的方法可用于确定该数值，通常都采用相同的单位表示（即事件数/秒）。 这两种事件率的计算方法为：
- 评估电子元件处理事件的最高速度
- 评估达到指定重合率时的最大事件率
了解制造商如何计算技术参数表中的该数值十分重要！
方法1
此方法为理论意义上的方法，它忽略了重合率以及其他仪器设计特点，如液流系统。因此，尽管电子元件能够以 10,000–100,000事件数/秒的速度处理事件，但根据泊松分布，该事件率对应的重合率可能远远超过普遍接受的10%的上限。近年来，随着更快速（但不一定是更高质量的）电子元件的出现，这种事件率参数的计算方式正日益受到认可；但注意，这种事件率的计算方式并未考虑重合事件。
方法2
此种仪器事件率的计算方法是基于10%重合率水平，这对研究人员来说更有意义( 图3 )。重合率越低，表示数据完整度越高。因此，使用这种方法最能代表可用于生成高质量数据的实际事件率对应的可接受重合率。若制造商使用该方法计算事件率参数，则用户可以更加确信数据在指定事件率对应的可接受重合率水平范围内。
如何进行对比
在对比仪器时，您应确保了解制造商采用何种方法计算事件率参数数值。制造商如使用第一种方法（电子元件处理速度）进行计算，您需在运行样品时注意重合率的问题。
特别注意：残留率
遗留率是指遗留并污染下一个样品的原始样品量，样品遗留将导致数据不准确( 图3 )。 遗留率的测量方法通常是先获取样品的固定体积，再获取无颗粒缓冲液（如，磷酸盐缓冲生理盐水（PBS））的固定体积。 随后，鉴别缓冲液中代表污染细胞的事件。 许多制造商通过运行特定细胞系或磁珠，确定指定条件下的遗留率数值。
如何进行对比
了解具体的指定条件以及使用哪种样品确定残留率数值十分重要。例如，参数测试所用的洗涤次数或者颗粒或细胞的大小或类型，可能与研究人员所用的完全不同。咨询制造商如何计算其残留率数值。了解不同制造商使用的不同计算方法，可助您根据参数值直接对比残留率。
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图 4. 软件。 技术参数表的软件部分可使研究人员了解系统内置软件的功能和特点。 该部分还对功能范围、用户定义功能、维护特点以及用户账户管理进行了说明。不同制造商生产的仪器具有不同的软件特点，有些系统配有独特的专有功能选项。
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图 5. 质量控制和监管。 质量控制和监管参数是指制造完整性、保修、现场安装工程程序和ISO认证。
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图 6. 数据管理。 数据管理部分对于成功的计算机安装和设置至关重要。 这一部分详述了RAM、硬盘驱动和FSC格式等规格。
特别注意：操作温度
单位为°C或°F
该参数常被忽视，但对仪器的终身使用价值非常重要，因为光学对准和液流系统与这些数值都密切相关( 图7 )。
如何进行对比
确定实验室是否处于相对恒定的温度以及仪器是否会在不同地方进行使用。仪器性能仅在规定温度范围内经过测试且具有保证，因此一定要注意操作条件。
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图 7. 安装条件。 标准装机条件部分描述了仪器的环境影响、操作条件和占地等信息。
特别注意：尺寸和重量
高 × 宽 × 深，单位为厘米（cm）或英寸（in.）；仪器重量单位为千克（kg）或磅（lb）
考虑仪器是否能够放置在通风橱内的预定空间或区域内。务必考虑自动采样器等配件的空间要求，并了解液流系统是否需要空间( 图7 )。许多流式细胞仪都具有外部液流装置，这大大增加了仪器所需的整体空间。如果仪器需要定期转移，应考虑其困难性。应注意，并非所有台式仪器都具有相同的空间需求或可转移性。
如何进行对比
在仪器演示时，应要求查看已安装所有组件的完整系统，从而可以直接对比每个系统所需的实际空间。
特别注意：微孔板分析速度
单位为分钟/96或384孔板
微孔板分析速度通常是指完整分析一个96或384孔板所需的时间( 图8 )。该定义包含两方面内容：一、样品体积；二、样品处理速度。应注意，该参数中报告的时间值越低，可能代表数据质量的损失越大。同时，务必明确在计算该数值时所用的分析样品体积以及样品处理速度。有些制造商展示的是通过收集小体积样品而最大限度减少微孔板处理时间的参数图。但这种操作实际上需要高度浓缩的样品，并会导致产生数据质量问题，如较高的重合率和丢失率。反之如果样品浓度不足，则小体积进样可能导致事件数过少而不具有统计学意义。
样品处理速度（样品进入液流系统的速度）还会影响数据质量。在采用流体动力学聚焦技术的流式细胞仪中，当流速增加时样品轴流会变宽并会造成细胞更广的分布（图2）。样品处理速度升高，将导致变异系数增大、检测精确度降低以及数据质量降低。在采用声波辅助流体动力学聚焦技术的仪器中，细胞紧密排列在细胞流的中心，不受样品处理速度的影响，所以信号变异系数更低，数据质量更高。因此，如果需要通过提高样品进样速度来缩短微孔板的处理时间，应选择采用声波聚焦技术的仪器，以避免数据质量降低。
微孔板分析速度的另一个影响因素是在不同样品进样之间是否冲洗进样针的问题。冲洗进针会延迟微孔板的分析时间，但不冲洗进样针可能会增加残留率—这是在指定参数条件下运行实验前需要考虑的一个因素。
如何进行对比
务必了解达到制造商技术参数表所述时间可能产生的数据质量损失。
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图 8. 进样器参数。 进样设备是流式细胞仪的配件。其参数包括采集时间、残留率和混合方法。其他信息还可能包括兼容的微孔板类型以及液流系统的选择。
结论
务必咨询与指定参数数值相关的测试，从而确保您准确比较仪器的性能。
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