在流式细胞术中，更亮总是更好么？

在流式细胞术中，更亮总是更好？

更明亮的荧光染料通常会使表达量小的抗原更易于观察，因为它们会提高阳性和阴性群体之间的分开程度，而不会增加非特异性结合的背景。如果只有单个靶标（即一个激光器、一个检测器、一个抗原）并且阳性群体的平均荧光强度 (MFI) 仍在检测器的动态范围内（即不超出范围），它们也可以很好地发挥作用。如果一个配色方案中有两个或多个荧光染料组合，则更明亮的荧光染料的优点就会变得复杂些。必须考虑每种染料与抗体的偶联物荧光特性，以了解它们如何影响彼此。很多荧光染料是由各种激光交叉激发，和/或由多个检测通道检测到。

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极明亮荧光染料的使用后果是什么？

NovaFluor 染料有何帮助？

极明亮荧光染料的使用后果是什么？

了解荧光染料的激发光谱和发射光谱图有助于预测它们的光谱特性对配色方案的影响。图1中的图像显示了 PE-eFluor 610的示例光谱。虽然这种串联染料主要由黄激光激发，但它也会被蓝激光大量交叉激发。同样地，该染料在主要检测器 (YL-2) 中发射良好，但它也有显著的荧光溢出到其他通道，如 YL-1。因此，虽然 PE-eFluor 610 非常明亮，适合于分辨很暗的细胞群，但其溢出和交叉激发会降低其他检测通道的检测清晰度。

图1.两幅图像都是根据 Spectra Viewer 荧光光谱查看工具并使用 Attune NxT 流式细胞仪的配置--蓝色/红色/紫色/黄色（V4）进行调整的。PE-eFluor 610 的激发光谱与标准的紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）激光线重叠，箭头指示黄色激光作为主要激发源，蓝色激光作为次要激发源。PE-eFluor 610 的主要激发源的发射光谱突出显示了主要检测器 YL-2 (620/15) 以及次要探测器 YL-1 (585/16)（右）。请注意，对于 PE-eFluor 610 ，第二检测器 YL-1 会出现明显的溢出。

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尽管流式配色方案中每个抗原都使用最明亮荧光染料似乎是一个美妙的主意，但可能会造成实验结果出现问题。图2中的示例数据显示了荧光染料的亮度并不总是越高越好。通过增加抗原密度和明亮的荧光染料（在本例 PE 中），主要检测器 (YL-1) 的亮度增加，二级检测器的亮度也增加 (见红色、粉色和紫色)。更明亮的偶联物会造成更多扩散，导致难以鉴定共表达细胞群体。如果 PE 偶联物的亮度降低，则细胞群分得越开、荧光染料的可用性更高。

图2.正常人外周血细胞用 Fc receptor 结合封闭剂(货号14-9161-73) 在 4°C 下处理了15分钟，然后使用流式抗体Panel进行染色。流式Panel包含 CellBlox 封闭缓冲液。我们建议使用 CellBlox Plus 封闭缓冲液以获得更好的结果（货号 C001T06F01）。右图的细胞分析都是基于对淋巴细胞设门的。为了说明其荧光扩散的增加，对 CD8a 中最明亮表达细胞 (CD8a Hi) 进行了设门 (CD8a Hi) ，使用 Attune NxT 流式细胞仪的配置--蓝色/红色/紫色/黄色 (V4) 收集数据。PE 的单染色对照（主要检测器 YL-1）补偿到 BL-2 检测器中，按抗原密度增加的顺序：未染色（黑色），CD197 (CCR7) 单克隆抗体 (3D12)，PE （货号 12-1979-42）（紫色），CD27 单克隆抗体（O323），PE (货号 12-0279-42)（粉色），CD8a 单克隆抗体（SK1），PE (货号 12-0087-42)（红色）。YL-2 检测器的 MFI（即亮度）和 BL-2 检测器的 RSD (即扩散)报告于每个群体旁（左）。CD197 (CCR7) PE（紫色）， CD27 PE（粉色），CD8 PE（红色）与匹配的共染色样品叠加，这些样品包括 CD62L (L- 选择素) 单克隆抗体 (DREG-56)，NovaFluor Blue 585 (货号 H009T03B04) (黑色) (右)。

NovaFluor 染料有何帮助？

克服由于荧光扩散导致的清晰度不足的最佳方法是使用光谱清晰的荧光染料完成流式Panel。NovaFluor 染料经过精心设计，可减少交叉激发和向其他非特异通道的溢出。在图3中，PE-eFluor 610 与光谱更为清晰的荧光染料取代 NovaFluor Yellow 610 进行比较。虽然两个荧光染料都在 Attune 上占据相同的主要检测器，但 NovaFluor Yellow 610 的蓝激光的标准化交叉激发减少了近65%，这导致在 Bl-2（受 PE-eFluor 610 影响较多的次级检测器）中的发射减少。考虑到 PE-eFluor 610 染料是一种更明亮的染料，这种交叉激发的影响会更大。

图3.两幅图像都是根据Specta Viewer荧光光谱查看工具并使用 Attune NxT 流式细胞仪的库存配置--蓝色/红色/紫色/黄色（V4）进行调整的。PE-eFluor 610（黄色）和NovaFluor Yellow 610（橙色）的激发光谱与蓝色（488 nm）和黄色（561 nm）激光线重叠（左侧）。显示因蓝色激光 (488 nm) 交叉激发而产生的同一两个荧光基团的发射光谱。这两种光谱均通过主要激发源黄色 561 nm 缩放。黄色框表示 BL-2 探测器 (590/40)（右）。

将更亮的 PE-eFluor 610 替换为更暗且更干净的 NovaFluor Yellow 610 理论上应该会导致溢出较少。为实际测试此假设，每个荧光基团都与同一抗体偶联，并用于对同一供体的相同细胞进行染色。在图4中， NovaFluor Yellow 610 的溢出和扩散明显低于 PE-eFluor 610，尽管其亮度较低，但仍可轻松鉴别 NovaFluor Yellow 610 阳性群体。

图4.用 Fc Receptor 结合封闭剂 (货号14-9161-73) 在 4°C 下处理了15分钟，然后使用流式Panel进行染色。流式Panel包含 CellBlox 封闭缓冲液。我们建议使用 CellBlox Plus 封闭缓冲液以获得更好的结果（货号 C001T06F01）。右图的细胞分析都是基于对淋巴细胞设门的。使用 Attune NxT 流式细胞仪的配置--蓝色/红色/紫色/黄色 (V4) 生成数据。YL-2 （主要）和 BL-2 （次级）检测器上 (A) 未补偿和 (B) 补偿的 CD4 单克隆抗体 (SK3) ， PE-eFluor 610 (货号 61-0047-42）（左 - 红色）和 CD4 单克隆抗体 (SK3)、NovaFluor Yellow 610（货号 H001T03Y03)（右–蓝色）的单染色对照。正总体（由矩形门指示）的百分比在右上角报告。

了解更多信息：流式细胞分析方法

过去，更明亮的荧光染料一直受到称赞，因为它能够检测到微弱的细胞群。然而，其中几种传统荧光染料因溢出到其他检测通道，而出现了大量的溢出和扩散。这里产生的溢出扩散可降低配色方案的清晰度，使其难以观察表达罕见或微弱的表达抗原，特别是对于共表达标记物而言。使用光谱更清洁的偶联物减少溢出扩散，可在不影响清晰度的情况下构建更大的流式配色方案。