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赛默飞Panel Builder流式配色
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轻松5步完成多色流式抗体配色
使用Panel Builder流式配色，您可以：
- 设计新的免疫分型实验，或者在您的Panel中添加抗体和试剂
- 使用您已有的抗体，设计新的免疫分型实验
- 同时使用光谱查看器，直接查看发射光谱重合
- 导出Excel表格，列出您选择的抗体，或直接下单
- 不仅适用传统流式细胞仪，更加出色完成光谱流式配色
如果您不仅使用了Panel Builder多色流式配色工具 ，还期望与流式科学家共同设计复杂流式Panel，赛默飞在全球遴选出一位位优秀的流式技术支持科学家，加速您的流式实验。我们深刻理解完成复杂流式配色十分花费时间、且劳心费神。虽然赛默飞不能代替做完实验，但流式科学家可以与您一起设计流式方案，充分考虑荧光溢漏，实现更加清晰的细胞分群。在使用这个Panel时，我们始终提供技术支持，优化流式Panel，得到最佳结果。点击赛默飞科学家流式配色，联系我们，开始流式配色。
开始使用Panel Builder流式配色
使用Panel Builder多色流式配色，可以轻松选出最佳荧光染料搭配。流式小白和大神都在用的Panel Builder流式配色工具可以与您一起轻松五步完成流式配色，加速流式实验进程。
教学视频：如何轻松上手Panel Builder流式配色工具
观看小片，了解简单5步如何轻松上手Panel Builder流式配色工具，设计您的流式抗体配色方案。
教学视频：如何设计光谱流式配色
观看小片，开始您的光谱流式配色旅程
五步轻松玩转Panel Builder流式配色
刚刚开始流式实验的小白？多年流式摸索经验的大神？Panel Builder流式配色工具都可以帮助您轻松五步选择流式仪器、抗原、荧光、抗体及最后总结，得到满意结果。
选择流式仪器
选择您的流式仪器是第一步，这里可以选择70多种流式细胞仪，同时显示相应仪器配置参数。
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如果这里的带通滤光片信息不准确，只需单击“edit cytometer settings”即可根据需要调整激光器、通道或带通滤光片配置。
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如果没有找到您的仪器，只需手动输入。选择激光器，设置检测通道和带动滤光片，完成仪器配置。
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选择抗原
在设计Panel时，您想使用实验室中重要抗体吗？如果是，请单击Yes，输入抗原名称、荧光染料，确认检测通道。然后单击“Confirm Selection”。
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现在首先选择实验物种，开始添加抗原。输入所需的抗原，单击“add another antigen”，完成所有抗原选择。
选择 Protein abundance（蛋白表达丰度），从高表达到低表达中选择。若不确定，可以选中等表达。在这里，蛋白表达强度可以帮助在Step 3中选择出更加合适的荧光染料。
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如果有指定的克隆，只需点击 More Options 选择想要的克隆。
想要使用Dump Channel吗？想要多个抗原靶标偶联在同一荧光染料吗？在这里，打开More options并将滑块向右拖动，然后选择Yes。这样，您可以将多个抗原使用到同一荧光检测通道。
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不要忘记Cell Viability Dye（细胞活性检测染料）！ 可以选择 fixable（可固定）或non-fixable（非固定）检测荧光染料。
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完成所有选择后，单击 Next Step（下一步）。
选择流式荧光染料
流式荧光染料选择指南主要基于每个荧光染料的光谱信息。在这里，当您选择了每个抗原的荧光染料后，可以直接在页面顶部看到荧光染料的光谱信息。
在选择荧光染料之前，每个抗体都显示了可用的检测通道。每当选定每个抗体后，页面顶部会直接显示其荧光光谱。在这里，可以看到每行是列出的抗原、每列是显示的通道。
在Step 2中选择的蛋白表达丰度会在这里推荐相应荧光染料，有小黑角标做提醒。
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开始选择流式荧光染料：第一行通常是从荧光染料选项较少的抗原开始选择。从上往下，最后选择荧光染料选项最多的抗原。 同时还有光谱信息，方便判断荧光染料选择是否合适。通常来说，光谱重叠越少越好。
继续选择，为所有抗原选择相应荧光染料。完成选择后，点击上方的Spectra Viewer，检查荧光染料选择结果。
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在每个激光下，可以看到所有荧光染料的完整光谱信息；基于仪器中滤光片配置，查看检测到的光学信息。同时确认理论荧光溢出值，避免结果误差。
如果未选到想要的流式荧光染料，只需单击“+ Add” 添加荧光染料。
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输入荧光染料名称，选择添加到Panel中。
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光谱流式实验配色
搭配复杂指数低的荧光染料。
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复杂指数
复杂指数很高表示数据解析很难，复杂指数很低意味着数据解析更容易、更准确。复杂指数越低，细胞分群效果越好，越容易区分出目标荧光染料。
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选择流式抗体
选择想要的规格以及流式抗体如果在Step 2没有指定克隆，这里会显示全部克隆。
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还想了解更多产品信息？点击产品中的figure，了解实验结果。直接点击产品名称，弹出产品页面，了解完整产品信息。
最后总结
完成产品选择后，在Step 5可以查看每个激光下选择的所有抗体，还有仪器滤光片配置下检测到的激发光谱。
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想再查看荧光溢漏？单击激光下的 View Spectra 即可查看光谱。
还不满意现在方案？您可以单击 Edit panel 返回编辑， 或者可以单击页面底部返回到前面步骤中。在使用过程中，可以点击进度栏返回前面步骤中。
当您检查完每一步、还很满意结果，流式配色也将要完成了。确定保存了您的流式配色结果，并且为其命名。这里可以选择以Excel或PDF下载流式配色结果数据，方便查看或打印。
最后，轻松添加您的流式Panel到购物车中，方便下单。在Step 5中直接显示您所选的抗体价格；单击 “Add all to cart”，这里所选的抗体都将添加到购物车中。
Invitrogen流式细胞仪面板构建器常见问题
- 我可以退一步而不失去我所做的工作吗？
- 是的，以前的工作会被保存下来。
- 我的标记没有显示在抗原的第2步下，但我在目录中看到它。我怎样才能补救这个问题？
- 首先选择你的目标物种，然后输入你的抗原。
- 我如何与我的实验室经理分享我的小组？
- 导出在第5步发现的电子表格。
- 在 "荧光剂 "步骤中，彩色的小点表示什么？
- 这些点表示赛默飞世尔科技公司在你所选择的细胞仪的每个通道中可用的荧光色素的数量。
- 我的细胞仪没有使用标准配置。我如何在下拉菜单中对一个配置进行修改？
- 从下拉菜单中选择一个细胞仪，然后选择 "编辑细胞仪设置 "链接，根据需要修改配置。
- 我在下拉菜单中找不到我的细胞仪。我可以建造一个吗？
- 是的，您可以使用细胞仪下拉菜单下方的 "手动输入您的细胞仪 "链接定义一个新的细胞仪。
- 我不通过thermofisher.com订购产品。我还可以使用哪些终端？
- 在总结步骤中，有PDF（可打印）和CSV（电子表格）两种输出，供你参考和订购之用。
- 我计划使用非赛默飞世尔科技公司的抗体，这个Panel Builder对我有什么用？
- 第2步允许使用您已经购买的或来自赛默飞世尔科技公司以外的抗体。如果您不能确定您想要哪种格式的东西，您可以在 "您需要的抗体 "部分添加抗原名称，然后在接下来的步骤中选择一个占位的荧光剂。这两种方法将帮助您跟踪那些为您不打算从赛默飞世尔科技公司购买的试剂保留的通道。
流式荧光染料选择指南
流式荧光发射光时有不同的亮度（图 2）。在Panel Builder上选择荧光染料时，赛默飞建议：
- 基于特定流式细胞仪，测试染色指数。流式厂家在他们的仪器上使用同一克隆、不同荧光基团的抗体测试出染色指数。也可以用流式微球得到染色指数，比如图 2 显示了在Attune NxT流式细胞仪上常见荧光染料的染色指数。每个流式细胞仪都有不同的激光、滤光片和检测通道，这都会影响到荧光染料偶联的标志物检测信号。
- 根据蛋白表达水平，搭配荧光染料的不同亮度。 仅仅使用非常明亮的流式荧光会导致荧光溢漏，并减弱标志物信号。
- 在每种抗体克隆及其荧光染料上，检测其平均荧光强度来比较亮度。这些可以在产品数据表中找到。
想要了解更多染色指数信息？想要查看BD LSRII 流式细胞仪上的染色指数？请点击： 流式细胞术多色流式配色方案设计：基础知识
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图 2.CD4 流式抗体上偶联的荧光染料的平均染色指数（Attune NxT 流式细胞仪上的结果）
图 2.CD4 流式抗体上偶联的荧光染料的平均染色指数（Attune NxT 流式细胞仪上的结果）
蛋白表达丰度（抗原密度）
了解您的蛋白表达丰度，可以更好地确定相应流式荧光染料。非常明亮的流式荧光染料适用于低表达丰度的靶标， 较暗的荧光染料更适合高表达丰度的靶标， 赛默飞建议：
- 基因表达水平会因细胞来源、刺激条件和固定方案而变化。
- 很暗的荧光染料可以检测高表达蛋白，而很亮的荧光染料方便检测低丰度蛋白。
- 使用流式补偿微球可以帮助确定抗原表达强度。各大基因遗传数据库也可以确定RNA表达水平。
最佳流式配色的快速技巧
赛默飞流式科学家 Natalie Oxford 分享了她的体会，尤其是在发表级流式配色上。
想要查看更多配色技巧？请点击：流式细胞术多色方案设计：基础知识
赛默飞流式荧光染料列表，包含其优点和类型。
了解荧光染料的激发光谱和发射光谱，请使用Invitrogen SpectraViewer。
Tip 1: Minimize spill-over by using the correct and separate channel
Any time you have markers that you know will be co-expressed on your cells of interest, make sure to space them out into separate channels.If you will need to use any adjacent channels, that's where you would put any markers that are mutually exclusive so that they'll still be easy to distinguish.
Tip 2: Intracellular targets need special buffer for fixation and permeabilization for staining
You'll also want to keep in mind the buffer that you're using to fix and permeabilize your cells, as we have several options.When you're looking at cytoplasmic targets, what the buffer is appropriate may not be the same as when you're looking at nuclear targets, because you want to make sure that you still have access to your antigens without over-fixing your epitopes.
Tip 3: Viability dyes are required to find live cells
A third tip I wanted to share with you is to always include a viability dye in your staining panel.This will help eliminate any false positives that are caused by dead cells or debris, because those can be sticky.You have a lot of options for choosing a viability dye, so you don't need to design your panel around them.You can build out the rest of your panel and optimize your core markers, and then fit in a viability dye in an empty channel.
Tip 4: Save your bright fluorochromes for dim targets
As you're building out your basic panel and you want to incorporate some more antigens, make sure you're keeping the density of your antigen expression in mind.So if you have antigens with low or unknown expression, those would be ones that you want to assign to your brightest dyes, such as PE or APC.
Tip 5: Try to combine negative markers in one channel (dump channel) to save space on your panel
A helpful trick when you want to exclude a lot of cell types at once without having to suck up multiple channels for that would be to use a dump channel.This is where you're placing all the antibodies that identify your cells that are not of interest into the same channel with the same fluorochrome, and then those can be easily gated out and all of the cells negative for the dump channel would be those that you use for your analysis going forward.
资源
由激光激发的荧光染料
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流式细胞仪
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资料
不得转售。Super Bright 聚合物染料是在Becton, Dickinson and Company的许可下销售。Brilliant Violet和PE-CF染料为Becton, Dickinson and Company专有。Cy™ 是Amersham Biosciences Corp的商标。Cy 染料为Amersham Biosciences Corp和Carnegie Mellon大学专有，并且依据 Amersham Biosciences Corp 的许可下进行生产和销售，仅用于研究和体外诊断用途。Brilliant Violet™ 是 Becton, Dickinson and Company 或其附属公司的商标或注册商标，并在其许可下使用。由 Sirigen™ 提供支持。