限制性内切酶关键注意事项

根据传统的定义，在最佳反应条件下，一个单位的限制性内切酶可以在1小时内，在 50 μL体系中 完全酶切 1 μL 定义底物（例如，质粒 pUC19）。尽管单位定义提供了一种测定方式，但还需注意，根据 DNA 底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型，针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。实际上，酶供应商往往根据 DNA 样本的潜在质量、数量和性质波动，推荐比完全酶切所需量多 5 至 20 倍的酶（或 1 μL 酶/反应体积）。

为确保限制性内切酶的有效活性，应按照制造商的建议妥善存储并在过期前使用。通常情况下，应将酶分成小等份，存储在 –20⁰C 条件下的无霜冰箱之中，从而在维持活性的同时最大限度避免反复冻融。DNA 样本应避免接触可能抑制酶并造成其它负面效应的污染物，如核酸酶、盐、有机溶剂（例如，苯酚、氯仿或乙醇）以及洗涤剂。

为避免在 –20°C 条件下结冰，限制性内切酶往往采用 50% 的甘油溶液形式提供。但甘油自身的粘度可能导致反应配制阶段移液和少量酶加样较为困难。最好是最后添加酶至终体积，添加之后就充分混匀。“用手指轻弹反应管”轻柔混匀，然后短暂离心反应管，可帮助酶在反应混合物中充分扩散，并在反应管底部收集到反应溶液。

在孵育过程中，反应须达到所需的温度，并在整个孵育期间保持恒定。如果使用 5-15分钟完全酶切的快速限制性内切酶代替1小时酶切的传统限制性内切酶时，这一点尤为重要。须格外谨慎地密封反应管以避免样本蒸发，否则可能造成孵育时间延长（例如，延长至>1 小时）和体积减少（例如，减少至 <10 μL）。

除了一般的注意事项外，在您进行实验时还需注意限制性酶切的以下方面：

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星号活性

星号或“松弛”活性是限制性内切酶的一种固有性质，即在非最优反应条件下，限制性内切酶可能会作用于与其天然识别位点存在细微差异的识别序列。例如，如图 1所示，EcoRI 可以识别和切割位点 5’-GAATTC-3’，但其星号活性可能导致序列在 5’-TAATTC-3’ 和 5’-CAATTC-3’ 处被切割。同样，BamHI 除了可切割其正常的识别序列 5’-GGATCC-3’ 外，还可切割 5’-NGATCC-3’、5’-GPuATCC-3’ 和 5’-GGNTCC-3’（其中 N 代表任意核苷酸）。

图 1.EcoRI 和 BamHI 两种常见限制性内切酶的潜在星号活性或松弛活性。

需特别指出，在最佳反应条件下，“星号”位点的切割率要远远低于正常的识别位点（大约相差 10⁵–10⁶）。因此，酶切期间出现星号活性的常见原因为限制性内切酶过量和/或孵育时间过长（过度酶切）。此外，高浓度甘油（例如，>5%）、低浓度盐、非最佳 pH、存在有机溶剂，以及除 Mg²⁺ 之外的二价阳离子都可能造成底物 DNA 的非特异性切割。使用酶制造商推荐的实验方案和缓冲液，可避免出现星号活性。

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不完全酶切

不完全酶切是在限制性内切酶使用过程中常遇到的问题之一。当酶量过多或过少时，都可能发生不完全酶切。DNA 样本中存在污染物也可能导致不完全酶切。缓冲液组分、孵育时间和反应温度等欠佳的反应条件是不完全酶切的常见原因。

部分限制性内切酶需要辅因子才能实现完全活性。例如，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性内切酶需要两个拷贝的识别位点才能实现有效切割；针对这一类酶，通常向反应物之中添加一份带有识别位点的寡核苷酸来增强酶活性。

除了反应条件和酶性质外，DNA 自身的性质也会影响限制性酶切（表 1）。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性内切酶的切割（详见甲基化部分）。酶的识别位点过于接近终端（线性底物 DNA 中）以及切割位点相邻（双酶切）都可能影响酶切割 DNA 的效率）。此外，部分超螺旋 DNA 分子要比线性 DNA 分子更难切割，增加 5-10 倍的酶量可有助实现完全酶切。

表 1.不完全酶切的常见原因。

酶供应商在产品说明书中提供了使用建议，为实现完全酶切，必须严格遵守此类建议。

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预料之外的切割图谱

即便遵守了制造商的使用说明，仍可能观察到预料之外的底物 DNA 切割结果。为避免陷入此类困境，必须确保酶和 DNA、反应所用的试剂均不含污染物（例如，其它限制性内切酶、DNA 和核酸酶）。

出现预料之外切割的一个原因是，在增殖和扩增过程中，底物 DNA 引入了突变。突变可能破坏已知的识别位点或创造出新的识别位点，从而产生预料之外的酶切结果。对 DNA 进行Sanger 测序，是一种判断突变是否引起底物 DNA 出现预期外切割的有效方法。

有时候预期之外的酶切图谱是由检测过程而非酶切过程造成的。部分限制性内切酶（例如，FokI，TauI）可能会与 DNA 紧密结合，导致电泳时出现明显的凝胶迁移。使用含 SDS 的上样染料，加热使酶从切割的 DNA 上解离开来，均可避免出现这类凝胶迁移现象（图 2）。

图 2.限制性内切酶与 DNA 结合可能导致电泳时条带拖尾。

星号活性和不完全酶切也会导致凝胶电泳时出现预料外的条带。因此，进行问题排除时必须区别这两种因素。一种区分方法是根据孵育时间。如果为星号活性，孵育时间越长，不理想条带通常越容易区分，而不完全酶切的不理想条带则会随着孵育时间延长而消失。此外，不理想条带的大小也是一种区分方式。部分源于星号活性的条带会比预期条带低，而不完全酶切的条带会高于最低预期条带（图 3）。

图 3.不完全酶切和星号活性的区分。

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甲基化

DNA 甲基化是真核和原核生物最常见的 DNA 修饰类型之一。在细菌体内，DNA 甲基化参与防御噬菌体感染的限制性修饰 (R-M) 防御系统（参见限制性内切酶基础知识），即保护宿主细菌自身的 DNA 不受内源性限制性酶切割。甲基化通常发生在胞嘧啶 (C) 和腺嘌呤 (A) 碱基处，主要形成 5-甲基胞嘧啶 (^m5C)、N⁴-甲基胞嘧啶 (^m4C) 和 N⁶-甲基腺嘌呤 (^m6A) 衍生物。

DNA 甲基转移酶可将来自供体的甲基基团转移到受体甲基（例如， A 和 C）上，催化甲基化反应。在实验室细菌菌株之中最常见的 DNA 甲基转移酶类型包括：

• Dam：代表脱氧腺苷甲基转移酶，可以将序列 5′-GATC-3′ 转化为 5′-G(^m6A)TC-3′
• Dcm：代表脱氧胞嘧啶甲基转移酶，可以将序列 5′-CCWGG-3′ 转化为 5′-C(^m5C)WGG-3′（其中 W 代表 A 或 T）
• EcoKI：代表大肠杆菌K12 菌株内的 Type I R-M 体系，可以修饰序列 5′-AAC(N)₆GTGC-3′ 内的腺苷
• EcoBI：代表大肠杆菌B 菌株内的 Type I R-M 体系，可以修饰序列 5′-TGA(N)₈TGCT-3′ 内的腺苷

在哺乳动物和植物系统中，CpG 或 CpNpG 甲基化是生物进程中常见的 DNA 修饰，因而成为了表观遗传学的主要焦点。

限制性内切酶对于甲基化 DNA 识别位点的敏感度因酶的种类而异。例如，如图 4所示，GATC 处的 Dam 甲基化完全阻断了 MboI，但是激活了 DpnI。而 5′-CCGG-3′ 的 CpG 甲基化阻断了 HpaII 活性，但却对 MspI 没有任何影响。在部分情况下，限制性内切酶的活性会受甲基化部分抑制（例如， XhoI）。

图 4.限制性内切酶对于底物 DNA 甲基化的敏感程度存在不同程度的差异。

在细菌内增殖质粒时，必须考虑到目标限制性内切酶甲基化的影响。为防止在 5′-GATC-3′ 和 5′-CCWGG-3′ 位点发生甲基化，质粒转化应选择缺少 Dam 和 Dcm 甲基化酶的感受态细胞 (dam^–/dcm^–) 。大多数大肠杆菌细胞不含 CpG 甲基化系统，因而从细菌分离的 DNA 不存在 CpG 甲基化问题。如果基因组 DNA 提取自植物和哺乳动物，则可能在 CpG 位点发生甲基化，再通过部分甲基化敏感的酶影响限制性酶切。

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质量/使用寿命

在选择限制性内切酶时，一个往往被忽略的因素是供应商的生产条例和质量流程。为获得可靠的结果并最大限度避免各次实验运行间结果波动，研究人员应了解酶供应商生产这类产品时采取的质控和质量保证措施。购买此类酶时应考虑的几个关键问题包括：

• 制造商的履历和资质如何？他们在限制性内切酶研究和开发方面是否具有长期良好的声誉和成就？─ 酶应该来自可靠的来源，才能获得一致的结果。
• 该类酶如何生产？认证的生产地点是否符合各种国际质量标准，如 ISO 9001 和无菌室环境？─ 确保酶产品可靠，最大限度避免批次间差异非常重要。
• 制造商的产能如何？针对大规模实验，他们能否提供大批量生产和定制包装？─ 对于全基因组或高通量研究，稳定的大规模和定制生产很重要。
• 酶的性能如何？接受过哪些测试？他们的活性、纯度和应用是如何测定的？这些测试是否足够灵敏，足以确保符合您的实验要求？─ 提供质量控制文档是质量保证的一个重要措施。
• 供应商提供的知识广度和深度如何？存在有关酶的疑问或产品相关的问题时，供应商是否积极提供了有益的支持？─ 深入理解产品和实时提供支持，是供应商行使合作伙伴职能的关键。

总之，并不是所有的限制性内切酶都是一样的。生产这类重要且关键的工具时所遵循的生产条例、质量控制和质量保证措施，是确保您的实验成功的关键，因此需要谨慎考虑。

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