GeneArt CRISPR核酸载体

CRISPR-Cas9 system greatly simplifies genome editing and has great promise in broad applications such as stem cell engineering, gene therapy, tissue and animal disease models, and engineering disease-resistant transgenic plants. When working with mammalian cells and there is no promoter constraints, we recommend using our GeneArt CRISPR Nuclease Vector. When working with difficult to transfect cell lines and for multiplexing, we recommend using our GeneArt CRISPR Nuclease mRNA system.

Figure 1. Available GeneArt CRISPR-Cas9 genome editing tools. The CRISPR-Cas9 system is composed of a short noncoding guide RNA (gRNA) that has two molecular components, a target-specific CRISPR RNA (crRNA) and an auxiliary trans-activating crRNA (tracrRNA). The gRNA unit guides the Cas9 protein to a specific genomic locus via base pairing between the crRNA sequence and the target sequence. Upon binding to the target sequence, the Cas9 protein induces a double-stranded break at the specific target sequence. Following CRISPR-Cas9–induced DNA cleavage, the break can be repaired by the cellular repair machinery using either nonhomologous end joining (NHEJ) or a homology-directed repair mechanism. With target specificity defined by a very short RNA-coding region, the CRISPR-Cas9 system greatly simplifies genome editing and has great promise in broad applications such as stem cell engineering, gene therapy, tissue and animal disease models, and engineering disease-resistant transgenic plants. We offer multiple solutions for genome editing, including CRISPR-Cas9 all-in-one expression vectors, Cas9 mRNA with options for producing target-specific gRNA, transfection reagents, and analysis tools.

基因组编辑采用人工核酸结合源性修复机制来改变细胞内的DNA。CRISPR/Cas系统充分利用了短gRNA的优势来靶向细菌Cas9核酸内切酶、定位遗传位点。由于gRNA能够提供特异性，更改靶标时，仅需要更改gRNA序列编码的设计。

基因编辑中所用的CRISPR/Cas系统包含三种组分：Cas核酸Cas9（双链DNA核酸内切酶）、一种靶向补充物crRNA以及一种辅助反式激活因子crRNA（图1）。GeneArt CRISPR核酸载体的crRNA和tracrRNA都以gRNA的方式一同表达，其中gRNA则在细菌系统中模仿天然的crRNA-tracrRNA嵌合体。所有需要做的工作就是引入一个编辑所需的序列的双链寡核苷酸，以表达契合体的crRNA部分。

图 1. CRISPR/Cas9 靶向的双链断裂。双链上均出现断裂，发生在靶向序列3端NGG前间区序列邻近基序(PAM)序列的3碱基对上游。

GeneArt CRISPR核酸载体试剂盒是用于表达哺乳动物细胞内CRISPR/Cas基因组编辑所需功能组分的报告基因载体系统。这一系列试剂盒现提供有不同的报告基因：带有OFP（橙色荧光蛋白）的GeneArt CRISPR核酸载体，支持Cas9和CRISPR RNA表达细胞群的流式细胞术分选(FACS) （图2A）；带有CD4的GeneArt CRISPR核酸载体，支持微珠法Cas9和CRISPR RNA表达细胞群富集（图2B）。

线性化GeneArt CRISPR核酸载体可提供快速、高效的双链寡核苷酸克隆方法，可将编辑crRNA（代表所需的靶标）的双链寡核酸克隆进可对Cas9进行序列特异性靶向的表达框架中。

图2. GeneArt CRISPR核酸酶载体图谱。使用预线性化的载体 (带有5个碱基对突出末端)，轻松克隆编码靶点特异性crRNA的双链DNA寡核苷酸。图谱为带有 (A) OFP报告基因和 (B) CD4报告基因的载体。gRNA、Cas9和报告基因均通过相同载体表达。Cas9通过核定位信号靶向细胞核 (NLS1和NLS2)。

切割效率可采用GeneArt基因组切割检测试验进行检测，这一技术采用错配检测内切酶方法来检测胞内NHEJ修复期间因合并插入和/或切除而产生的插入或缺失。

图3. CRISPR/Cas9介导的切割效率。采用GeneArt基因组切割检测试验（计划于2014年1月发布）研究HPRT位点时的凝胶图像。(A) 采用表达HPRT特异性CRISPR RNA的GeneArt CRISPR核酸OFP载体获得的结果。(B) 采用表达HPRT特异性CRISPR RNA的GeneArt CRISPR核酸CD4载体获得的结果。在转染进HeLa细胞后，进行三联切割试验，并计算插入或缺失的百分比。

由于Cas9基因与OFP或CD4连接，使用GeneArt CRISPR核酸多功能载体系统时的使用效率可采用荧光显微镜或FACS（如为含有OFP的质粒），或采用抗CD4荧光抗体（如为CD4质粒）进行监测。

图7. 表达Cas9和gRNA的细胞群的富集。(A) 使用靶向RelA 位点的GeneArt CRISPR核酸OFP载体编码的crRNA时，在293T细胞中的沾染效率。数据显示，感染的样本中含有超过90%的OFP阳性细胞。(B) GeneArt CRISPR核酸CD4载体的CD4功能。293 FT细胞转染了AAVS1特异性的GeneArt CRISPR核酸CD4载体。采集细胞并采用抗CD4 FITC抗体染色，之后采用流式细胞仪进行分析以测定转染效率。一部分染色的细胞还被接种到一个平板上，以便采用荧光显微镜进行分析。

敬请电邮service.cn@thermofisher.com告知我们，我们将为您设计并提供100 µg的转染级纯度DNA。

仅限研究用途，不可用于诊断操作。