Invitrogen TrueDesign 基因组编辑工具

Invitrogen TrueDesign 基因组编辑工具是一个免费的在线工具，能够让不同经验水平的科学家轻松设计、选择和订购试剂，从而保证既准确又成功的基因编辑实验。

TrueDesign 基因组编辑工具支持的实验类型

基因编辑类型	敲除目标基因	敲入 GFP 或 RFP 标签	插入、删除或替换多达30个碱基	SNP替换
描述	定点插入终止密码子或 indel 序列	不需要克隆就能标记目标基因	使用 CRISPR-Cas9 或 TALEN 技术在任何人、小鼠、大鼠、斑马鱼或线虫的基因中	将单核苷酸编辑引入目标基因中
用户指南	Indel 用户指南终止密码子用户指南	荧光标签用户指南	基因插入用户指南基因删除用户指南	SNP 替换用户指南

下载工作流程示意图

我们还提供预设计的化学合成和慢病毒包装的向导RNA ，用于人类或小鼠目标基因的直接敲除，此外还可让您在线轻松订购我们的定制合成 sgRNA。

TrueDesign 还使您能够：

一键订购或导出设计
将所有实验试剂添加到购物车或下载一份完整报告
验证 CRISPR-Cas9 编辑
使用定制设计的引物进行测序或切割检测分析

TrueDesign工具支持六种类型的编辑—基因敲除、荧光标记、插入、替换、删除和 SNP 替换。每一个 gRNA 设计都附带了成功编辑所需的试剂清单，可以一起订购，便于完美配合使用。我们的研究表明，改进 gRNA、Cas9 核酸酶和供体 DNA 的设计和递送有助于提高 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑效率。[1]

操作视频

下载 TrueDesign 应用指南

TrueDesign Genome Editor 软件工作流程

TrueDesign工具遵循一个简单的三步工作流程：选择您的基因和转录本，确定您的编辑类型，并根据我们的建议设计您的 CRISPR和/或TALEN 序列。最后，您会进入汇总页面，可以检查设计，下载所需的试剂清单并将它们添加到购物车中。

在这个例子中，我们将一个 GFP 标签添加到 ACTB 基因的 N 末端上。

在选择步骤中，选择您想要进行的编辑类型，并确定您想要修饰的物种和基因。然后从 TrueDesign 工具生成的列表中选择转录本。

在编辑步骤中，如有必要，选择编码区域并确定修饰的细节—在这个例子中，需要基因ACTB的N末端添加GFP标签。我们还会插入一个选择标记基因来富集带标签的细胞，方便之后使用嘌呤霉素去除未被编辑的细胞。

在设计步骤中，这个工具找到并评估 CRISPR 和 TALEN编辑靶点以完成编辑，带有绿色对勾标记的为推荐的最佳设计。选择您想要的目标。

当没有合适的 CRISPR PAM 位点可用于您的设计时，TALEN技术非常有用。对于难以编辑的基因组区域（如异染色质），它也可能比 CRISPR 更有效。[2]

设计完成后，汇总页面会让你检查设计，并列出完成基因编辑需要或推荐的所有试剂。您可以选择想要的产品并将其添加到购物车中，或者将它们导出到电子表格中，其中包含设计和推荐方案的完整详细信息。

样本数据
常见问题解答
版本说明

GFP 标记

该实验显示了把拓展工作流程示例中的设计应用于 U2OS 细胞时的结果，编辑 ACTB 基因以生成 N 端和 C 端带GFP 标签的肌动蛋白。使用推荐的 gRNA 序列 GCTATTCTCGCAGCTCACCA (PAM TGG)，正向和反向引物与 TrueTag 供体 DNA 试剂盒一起用于扩增供体模板。在成功扩增和纯化供体 DNA 后，将其与 gRNA 和 Cas9 蛋白共转染到细胞中。

显微镜图像显示了表达带 GFP 标签的 ACTB 的 U2OS 细胞（绿色），用 Hoechst 核染料复染（蓝色）。绿色肌动蛋白丝在成功编辑的细胞 (B) 和阴性对照 (A) 中清晰可见。当使用嘌呤霉素筛选被编辑的细胞时，通过流式细胞仪定量分析，GFP 阳性的细胞比例可高达近 100% 。详细工作流程参见TrueTag 供体 DNA 试剂盒用户指南。

ACTB 标记的细胞（绿色），用 Hoechst 染料复染（蓝色）。(A)阴性对照和(B)编辑过的细胞，能清晰显示出表达 GFP-ACTB 融合蛋白的肌动蛋白丝。(C)三个实验的总结，其中对于N-末端标签而言，应用嘌呤霉素可以筛选到>80%的 GFP 阳性细胞，而对于C-末端标签而言，可以筛选到>99%的阳性细胞。图像是在 Invitrogen EVOS FL 彩色成像系统上拍摄的。

我需要创建一个访问TrueDesign工具的帐户吗？
- 是。由于该软件通过 Thermo Fisher 云维护，因此有一个登录步骤。但是，创建帐户和/或登录是完全免费的，且非常简单和便捷。
创建 Thermo Fisher 云账户需要输入哪些信息？
- 您需要输入的唯一信息是名字、姓氏、电子邮件和密码。如果你以前在 thermofisher.com网站下过订单，你可能已经有账户了。
使用 Thermo Fisher云帐户，我还可以访问哪些东西？
- 拥有一个账户有很多好处，例如：
  - 获取客户专有价格和在线报价
  - 查看和跟踪现有或过往订单，以及快速重新订购
  - 加入 Aspire 会员计划，即可获得免费的全尺寸产品
  - 访问在线科学服务商城购物
  - 利用1TB的免费数据存储、科学分析应用程序和同行协作工具
如果我注册了 Thermo Fisher 帐户，是否会收到大量垃圾邮件或促销邮件？
- 创建帐户时，您可以选择不通过电话、电子邮件或任何其他电子方式接收任何关于 Thermo Fisher 产品和服务的信息。如果您已经有一个帐户，请单击最右上角的头像，会显示一个下拉菜单。从该菜单中，单击“帐户”，设置您的首选项。
如果卡住或需要其它帮助，我该怎么做？
- 点击此链接与 Thermo Fisher 科学家交流，了解更多关于 TrueDesign 工具的信息。此外，您可以直接向技术应用科学家发送邮件，邮箱地址：Lifescience-CNTS@thermofisher.com。
有哪些工具可用于30个以上碱基对的插入或删除编辑？
- 这些编辑需要一个超过100nt的 DNA 供体作为模板，通常是双链 DNA 或质粒供体。TrueDesign 软件目前支持插入和删除的设计，通过一个100nt ssDNA供体寡核苷酸来实现编辑。
我必须购买汇总页面上显示的所有推荐产品吗？
- 开展实验唯一需要的产品是 CRISPR 或 TALEN 试剂，DNA供体或 TrueTag 引物。在将具体基因产品添加到购物车之前，可以取消选择所有其他推荐产品。您还可以将设计和结果导出为 Excel 表格。请注意，取消选择的产品都不会出现在电子表格中。
点击“设计”后要等多久？
- 取决于多个因素，加载设计可能需>要30秒到2分钟。计算机运行速度、互联网带宽和设计要求的复杂性都会影响设计步骤的速度。
支持哪些浏览器？
- 支持以下浏览器及其后续版本: Internet 10及更新版本、谷歌 Chrome 23及更新版本、Apple Safari 5及更新版本、Mozilla Firefox 16及更新版本。
为什么我的账户没反应？
- 通过支持的浏览器，使用您的用户名和密码登录到Thermo Fisher云。验证请求电子邮件将发送到您的在线帐户保存的电子邮件地址。如果您没有收到此验证请求，请检查您的垃圾邮件文件夹。
我需要下载什么东西吗？
- 不需要。TrueDesign 是一个完全免费的在线工具。为了保存设计细节：您务必导出结果文件，因为结果不会保存在云中。
我搜索了一个基因，网页显示多个转录本。我如何知道选择哪个转录本？
- 转录本的选择取决于实验的预期结果。您可能想要编辑稀有转录本中的一个独特区域，或者想要编辑所有转录本中都有的一个保守区域。TrueDesign 工具提供跳转到NCBI的链接，因此您可以轻松进行转录本比对并选择最符合您需求的选项。
敲除和删除实验有什么区别？
- 敲除实验将为您提供 gRNAs 设计的多种选择，引入小的插入和缺失 (indels)导致移码突变，或者插入多个STOP密码子来终止转录。这两种方法都可以实现功能性敲除。
- 删除实验利用一个 gRNA 和一个 ssDNA 供体精确地删除多达 30 个碱基的特定基因组区域。例如，删除某个特定氨基酸。尽管这可以用作功能性敲除的策略之一，但它是专为精确编辑目标基因而设计的。
如果我还没有准备好下单，如何保存 gRNAs、供体和引物的信息？
- 在设计基因编辑实验后，在最后的“汇总”页面上，您可以选择下载一个电子表格，其中包含进行基因编辑实验所需的所有序列信息、试剂类型和产品订购信息。在此汇总页面中，您还可以选择将所有试剂添加到购物车中。
如何使用 STOP 密码子进行敲除？
- 当选择敲除实验类型时，您将看到插入 STOP 密码子的选项，这是实现功能性敲除的方法之一。这个策略使用一个 gRNA （造成双链 DNA 断裂）和一个 ssDNA 供体在转录起始位点插入多个终止密码子。这会干扰目标蛋白的翻译。
如何使用 TrueDesign 工具替换一段基因组 DNA？
- 可以通过选择删除实验来进行替换。对于第一个突变，您可以选择要删除的 DNA 区域（最多 30 个碱基）。然后，选择插入作为同一实验中的第二个突变来替换编码区的删除部分。
如果我的实验没有返回 CRISPR gRNA 设计怎么办？
- 如果在设计步骤中未返回 CRISPR gRNA 设计，可能有两个原因：(1) 选择用于编辑的基因组区域不包含CRISPR-Cas9 PAM位点（NGG基序）或 (2) 发现的所有 gRNA 设计都被认为脱靶效应过高而无法发挥作用。如果出现这种情况，TrueDesign 软件将建议使用不受PAM 位点限制的 TALEN。

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4.0 版的主要功能包括以前版本的功能，并增加了以下功能：

增加了一个多达 30 bp（用于编辑氨基酸序列）的“替换”功能
增加了与上下文有关的工具提示
增加了用于订购 FlexCut TALEN mRNA 对的“添加到购物车”功能
最常见的 RefSeq 转录本将显示在列表的顶部（人类和老鼠）
一键链接到 NCBI 基因视图，查看转录图
鼠标悬停显示转录本中的氨基酸数量
通过颜色高亮编辑同源臂，更好地可视化 DNA 供体设计
重排汇总页面，将相似的产品组合放在一起
增加了一个开始新实验的选项
增加了访问 “定制服务报价请求” 页面的按钮
结果文件可下载，其中包含一个目录，引导用户找到标签上的数据

3.0 版的主要功能包括以前版本的功能，并增加了以下功能：

支持额外四个基因组中的编辑设计，包括人类 (hg38)、小鼠 (mm10)、大鼠 (rn6)、斑马鱼 (danRer11)和蛔虫（秀丽隐杆线虫，ce11）基因组。
使用 TrueGuide 文库里预设计的 gRNAs或从头设计 gRNA 和 TALEN ，针对所有物种都可设计敲除实验。
使用包含多个 STOP 密码子的供体设计敲除实验。
在编辑步骤中显示编辑汇总表。
改进了用户界面、设计流程和结果可视化，可以对单个基因座进行多次编辑。
改进 CRISPR 设计算法，设计时间减少了56%。
展示 gRNA， TALEN 设计与供体设计。
改进了引物设计算法，支持使用 Applied Biosystems SeqScreener Gene Edit Confirmation 应用程序进行测序分析。
提高了序列编辑器的可用性。
在设计导出文件中显示转染方案。
在汇总页面显示基因组编辑插图。
重排了汇总页面上所需和推荐试剂的展示。