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使用数字 PCR 进行细胞和基因治疗开发
细胞和基因治疗的病毒载体和质粒开发
随着对细胞和基因治疗的需求不断增加，对病毒载体和质粒 DNA 开发的需求也越来越大。基因和细胞治疗需要使用各类病毒载体进行基因转移，其中包括腺相关病毒（AAV）、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒等。其中，AAV 介导的基因治疗因其安全特性而受到广泛关注，因为其载体感染不具有致病性，同时 AAV 无法自行复制。 AAV 病毒载体以及来自质粒 DNA 模板的信使 RNA 是生产和携带嵌合抗原受体（CAR）至 T 细胞的关键中间体，可实现 CAR-T 疗法。
准确测定基因疗法中的病毒滴度
控制潜在治疗的病毒滴度非常困难，因为病毒颗粒是在活细胞中生产，然后纯化出来的。 在生成和纯化病毒载体的过程中，也极易受到宿主细胞 DNA、支原体和其他污染物的污染。 为确保制备正确的制剂，必须准确、精确且一致地测量病毒滴度。 为确保产品的质量和安全性，必须以极高的灵敏度进行有害外来因子（病毒、细菌和真菌）及污染 DNA 的检测和筛选。
虽然实时荧光定量 PCR 仍然是治疗性病毒载体（如用于细胞和基因疗法的 AAV）定量分析的金标准工具，但在病毒载体生产和表征需要进行的一系列分析测定中，数字 PCR（dPCR）对于目标 DNA 分子定量具有显著优势。
与实时荧光定量 PCR 不同，dPCR 可以提供核酸的绝对计数，实现 AAV 载体、细菌污染物和残留宿主细胞 DNA 的精确定量。dPCR 无需参考标准品，精确度更高，并且没有变异源。实时荧光定量 PCR 使用的标准曲线的变异性通常有一部分是相关 DNA 种类的不同结构（环形、超螺旋、线性 DNA）或病毒颗粒所致。dPCR 检测影响扩增的污染物（包括 AAV 介导基因疗法开发中所用溶液中存在的污染物）时的灵敏度也偏低。
Absolute Q 病毒滴度 dPCR 检测试剂盒
Applied Biosystems Absolute Q 病毒滴度 dPCR 检测试剂盒可以轻松准确地对病毒载体进行定量。该试剂盒可以单独运行，或者使用目标靶基因的定制试剂盒进行多重检测，以测量浓度并评估生物制药和基因治疗研究的质量。
Absolute Q dPCR 检测试剂盒具有以下特征：
- 简单——工作流程简化、易于使用，可与您的数字 PCR 仪配合使用
- 快速——手动操作时间极短；与 QuantStudio Absolute Q 数字 PCR 系统配合使用时，可在90分钟内获得结果
- 可靠——我们的试剂盒经过验证，提供性能保证*，可以放心使用所产生的数据进行分析
从我们这里购买每一种预先设计的 Absolute Q dPCR 检测试剂盒都可以获得我们的全套售后服务
所有用于 dPCR 实验的预先设计的 Absolute Q 检测试剂盒的性能均在质保范围内。我们这款检测试剂盒是针对特定应用的产品组合，质量上乘、性能优越。这些检测试剂盒采用最新的基因注释和金标准 Applied Biosystems TaqMan 化学试剂，经过精心设计和充分验证。
如果 Absolute Q 数字 PCR 检测试剂盒的性能不符合一致性文件所述，我们将提供免费换货服务，或把相应款项计入您的账户。*
图1.在 QuantStudio Absolute Q dPCR 系统上对 AAV 和 CMV 病毒载体稀释系列进行定量分析。
图2.采用 Absolute Q（TM）AAV 和 Absolute Q（TM）CMV dPCR 检测试剂盒，在多个数字 PCR 平台上对 AAV 和 CMV 病毒载体稀释系列进行定量分析。
Poster: Fully-integrated digital PCR system for robust and consistent viral titer quantification
Unlike other dPCR methods that rely on stochastic processes to generate micro-reactions by droplet formation, microfluidic array plate (MAP) technology facilitates automated sample distribution consistently into over 20,000 microchambers and utilizes >99% of the bulk reaction to minimize sample loss. Here we demonstrate how the increased robustness and consistency possible with MAP technology improves AAV viral titer quantification by performing comparison experiments using the Applied Biosystems™ QuantStudio™ Absolute Q™ Digital PCR system, as well as a comparison performed using a droplet digital PCR instrument.
Characterization of AAV Genomic Titer on the Applied Biosystems™ QuantStudio™ Absolute Q™ dPCR System
Quantification of genomic copies (GC/mL) is important for characterizing rAAV. While quantitative PCR (qPCR) is considered the gold standard method for determining the genomic titer, this approach requires the use of standard curves and is thus more susceptible to variation from run to run. dPCR provides significant advantages for analytical assays necessary for viral vector production and characterization without the need for a standard curve. dPCR is also less sensitive to contaminants that affect amplification, including those present in solutions used during the development of AAV-mediated gene therapies.
补充预混液
Absolute Q DNA 数字 PCR 预混液（5X）经过优化，可与 QuantStudio Absolute Q 数字 PCR 系统和 Absolute Q 数字 PCR 检测试剂盒配合使用，工作流程简单，处理步骤极少。 5X 制剂可分析更高的样品体积，无需使用标准曲线即可准确定量 DNA 靶标。
主要产品特点：
- 快速获得结果——手动操作时长5分钟，大约90分钟获取结果
- 灵敏度高——可检出低至 0.1% 的变异等位基因频率
- 多重检测优化升级——在单次反应中检测多达4个靶标
订购信息
Absolute Q 病毒滴度检测试剂盒
Absolute Q DNA 数字 PCR 预混液
相关资源
*适用条款和条件。有关质保的完整详细信息，请访问 thermofisher.com/absoluteqassayguarantee
仅供科研使用，不可用于诊断目的。